Çift sarmallı RNA (dsRNA) ELISA KİTİ

Bu kit, diziden bağımsız olarak 60 baz çiftinin (bp) üzerinde uzunluğa sahip dsRNA'nın kantitatif ölçümü için biyotin-Streptavidin sistemi ile bir Enzim Bağlantılı İmmünosorbent Testi (ELISA) birleşimidir.Plaka anti-dsRNA antikoru ile önceden kaplanmıştır.Numunede bulunan dsRNA eklenir ve kuyucuklar üzerinde kaplanmış antikorlara bağlanır.Daha sonra biyotinlenmiş anti-dsRNA antikoru eklenir ve numunedeki dsRNA'ya bağlanır.Yıkamanın ardından HRP-Streptavidin eklenir ve Biyotinlenmiş anti-dsRNA antikoruna bağlanır.İnkübasyondan sonra bağlanmamış HRP-Streptavidin yıkanarak uzaklaştırılır.Daha sonra TMB substrat çözeltisi eklenir ve HRP tarafından katalize edilerek asidik durdurma çözeltisi eklendikten sonra sarıya dönüşen mavi renkli bir ürün elde edilir.Sarının yoğunluğu plakada yakalanan dsRNA'nın hedef miktarıyla orantılıdır.Absorbans 450 nm'de ölçülür.

Başvuru

Bu kit artık dsRNA'nın kantitatif ölçümü içindir.

Kit bileşenleri

Depolama ve Stabilite

1. Kullanılmayan kit için: Kitin tamamı raf ömrü boyunca 2~8°C'de saklanabilir.Depolama stabilitesi için güçlü ışıktan kaçınılmalıdır.

2. Kullanılmış kit için: Mikroplak açıldığında, lütfen kullanılmayan kuyucukları plaka kapatıcıyla kapatın ve kurutucu paketi içeren folyo poşete geri dönün, folyo poşeti fermuarla kapatın ve kullanımdan sonra mümkün olan en kısa sürede 2~8°C'ye geri dönün.Diğer reaktifler kullanımdan sonra mümkün olan en kısa sürede 2~8°C'ye döndürülmelidir.

Gerekli Ancak Sağlanmayan Malzemeler

1. 450±10 nm filtreli mikroplaka okuyucu (450 ve 650 nm dalga boyunda tespit yapabiliyorsa daha iyi).

2. Mikroplak çalkalayıcı.

3. RNaz içermeyen uçlar ve santrifüj tüpleri.

Operasyon Akış Şeması

Sen başlamadan önce

1. Kullanmadan önce tüm kit bileşenlerini ve numunelerini oda sıcaklığına (18-25°C) getirin.Kit bir defada kullanılmayacaksa, lütfen sadece mevcut deneye ait stripleri ve reaktifleri çıkarın ve kalan stripleri ve reaktifleri gereken durumda bırakın.

2. Yıkama tamponu: 800 mL 1x yıkama tamponu hazırlamak için 40 mL 20x konsantre yıkama tamponunu 760 mL deiyonize veya damıtılmış suyla seyreltin.

3. Standart: Kullanmadan önce stok solüsyonu kısa bir süre döndürün veya santrifüj edin.Sağlanan dört standardın konsantrasyonu 5ng/μL'dir.UTP ve pUTP dsRNA standartları için lütfen standart eğriyi çizmek için stok çözeltisini STE tamponu ile 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL'ye seyreltin.N1-Me-pUTP dsRNA standartları için lütfen standart eğriyi çizmek için stok çözeltisini STE tamponu ile 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL'ye seyreltin.5-OMe-UTP dsRNA standardı için lütfen standart eğriyi çizmek için stok çözeltisini STE tamponu ile 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL'ye seyreltin.Standartların aşağıdaki çizelgelere göre seyreltilebilmesini öneririz:

4. Biyotinlenmiş tespit antikoru ve HRP-streptavidin çalışma solüsyonu: kullanımdan önce stok solüsyonu kısaca döndürün veya santrifüjleyin.Seyreltme tamponu ile bunları çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin.

5. TMB alt durumu: solüsyonun gerekli dozajını sterilize edilmiş uçlarla aspire edin ve kalan solüsyonu tekrar şişeye boşaltmayın.TMB alt katmanı ışığa duyarlıdır, TMB alt katmanını uzun süre ışığa maruz bırakmayın.

Protokolü kullanma

1. Test için gereken şerit sayısını belirleyin.Şeritleri kullanmak üzere çerçevelere yerleştirin.Bu tahlilde kullanılmayan kalan plaka şeritleri, kurutucuyla birlikte torbaya yeniden paketlenmelidir.Buzdolabında saklamak için torbayı sıkıca kapatın.

2. Uygun kuyucuklara standart, kör ve numunelerin her bir dilüsyonundan 100μL ekleyin.Plaka kapatıcıyla örtün.500 rpm'de çalkalanarak oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.Numuneler, doğru test için uygun konsantrasyona kadar STE tamponu ile seyreltilmelidir.

3. Yıkama adımı: Solüsyonu aspire edin ve her kuyucuğa 250μL yıkama tamponu ile yıkayın ve 30 saniye bekletin.Plakayı emici kağıt üzerine oturtarak yıkama tamponunu tamamen atın.Tamamen 4 kez yıkayın.

4. Her kuyucuğa 100μL biyotinlenmiş tespit antikoru çalışma solüsyonu ekleyin.Plaka kapatıcıyla örtün.500 rpm'de çalkalanarak oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.

5. Yıkama adımını tekrarlayın.

6. Her kuyucuğa 100μL HRP-streptavidin çalışma solüsyonu ekleyin.Plaka kapatıcıyla örtün.500 rpm'de çalkalanarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

7. Yıkama adımını tekrar tekrarlayın.

8. Her kuyucuğa 100μL TMB substrat solüsyonu ekleyin.Plaka kapatıcıyla örtün.Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.Substrat çözeltisinin eklenmesiyle sıvı maviye dönecektir.

9. Her kuyucuğa 50μL stop solüsyonu ekleyin.Durdurma solüsyonunun eklenmesiyle sıvı sarıya dönecektir.Daha sonra mikroplaka okuyucuyu çalıştırın ve ölçümü hemen 450 nm'de gerçekleştirin.

Sonuçların Hesaplanması

1. Her standart, kontrol ve numune için çift okumaların ortalamasını alın ve ortalama sıfır standart optik yoğunluğu çıkarın.Dikey(Y) ekseninde absorbans ve yatay(X）ekseninde) dsRNA konsantrasyonuyla standart bir eğri oluşturun.

2. Hesaplamanın, curve Expert 1.3 veya ELISA Calc gibi bilgisayar tabanlı eğri uydurma yazılımları ile 5 veya 4 parametreli doğrusal olmayan uyum modelinde yapılması tavsiye edilir.

Verim

1. Hassasiyet:

alt tespit sınırı: ≤ 0,001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA için), ≤ 0,01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA için).

alt nicelik sınırı:0,0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA için),0,0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA için),0,0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA için).

2. Kesinlik: Test İçi CV ≤%10, Testler Arası CV ≤%10

3. Kurtarma:%80~%120

4. Doğrusallık: 0,0156-0,5pg/μL(UTP-,pUTP-dsRNA için)0,0312-1pg/μL(N1-Me-pUTP dsRNA için),0,0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA için).

Hususlar

1. TMB reaksiyon sıcaklığı ve süresi kritiktir, lütfen bunları talimatlara göre sıkı bir şekilde kontrol edin.

2. İyi bir test tekrarlanabilirliği ve hassasiyeti elde etmek için, reaksiyona girmemiş reaktiflerin fazlasını uzaklaştırmak amacıyla plakaların uygun şekilde yıkanması önemlidir.

3. Tüm reaktifler kullanılmadan önce iyice karıştırılmalı ve numune veya reaktiflerin eklenmesi sırasında kabarcıklardan kaçınılmalıdır.

4. Konsantre yıkama tamponunda (20x) kristaller oluşmuşsa, 37°C'ye ısıtın ve kristaller tamamen eriyene kadar yavaşça karıştırın.

5. Sodyum Azit (NaN3) içeren numunelerin testinden kaçının; zira bu, HRP aktivitesini yok ederek dsRNA miktarının eksik tahmin edilmesine neden olabilir.

6. Test sırasında RNaz kontaminasyonunu önleyin.

7. Standart/numune, tespit antikoru ve SA-HRP çalkalamadan oda sıcaklığında da yapılabilir ancak bu durum tespit hassasiyetinin bir kat azalmasına neden olabilir.Bu durumda, UTP ve pUTP dsRNA standartlarının 2pg/μL'den, N1-Me-pUTP dsRNA standartlarının 4pg/μL'den ve 5-OMe-UTP dsRNA standardının 8pg/μL'den seyreltilmesini öneriyoruz.Ek olarak HRP-streptavidin çalışma solüsyonunu oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin.Balon çalkalayıcıyı kullanmayın çünkü balon çalkalayıcı hatalı sonuçlara neden olabilir.

Tipik sonuç

1. Standart eğri verileri

2. Standart eğri hesaplaması

3. Astar tespit aralığı: 0,0312- 1pg/μL