M-MLV Ters Transkriptaz
RevScript Ters transkriptaz, genetik mühendisliği teknolojisiyle elde edilir.Daha yüksek cDNA sentez kabiliyetine, termal stabiliteye ve reaksiyon sıcaklığı sınırına (60°C'ye kadar) sahiptir.Sentezlenen cDNA ürünü 10 kb'ye kadardır.Şablonların afinitesini arttırır ve karmaşık ikincil yapıya veya düşük kopya genlere sahip RNA şablonlarının ters transkripsiyonu için uygundur.
Bileşenler
| Bileşen | HC2003B-01 (10.000U) | HC2003B-02 (5*10.000U) | HC2003B-03 (200.000U) |
| RevScript Ters Transkriptaz (200U/μL) | 50 μL | 5×50 mcL | 1 ml |
| 5 × RevScript Arabelleği | 250 mcL | 1,25 mL | 5 ml |
Saklama Durumu
Bu ürün -25°C~-15°C'de 2 yıl süreyle saklanmalıdır.
Birim Tanımı
Bir ünite, primer olarak Oligo(dT) kullanılarak 37°C'de 10 dakikada asitte çözünmeyen malzemeye 1 nmol dTTP katar.
Reaksiyon Kurulumu
1.RNA şablonunun denatürasyonu (Bu adım isteğe bağlıdır, RNA şablonunun denatürasyonu ikincil yapıların açılmasına yardımcı olur, bu da ilk cDNA dizisinin verimini artıracaktır.)
| Bileşenler | Hacim (μL) |
| RNaz içermeyen ddH2O | 13'e kadar |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) veya Rastgele Astar (50 μmol/L) Veya Gene Özel Primerler (2 μmol/L) | 1 |
| veya 1 | |
| veya 1 | |
| RNA şablonu | Xa |
Notlar:
1) a: Toplam RNA: 1-5 ug veya mRNA: 1-500 ng
2) 65°C'de 5 dakika inkübe edilir, daha sonra 2 dakika soğuması için hemen buz üzerine aktarılır.Reaksiyon sıvısını toplamak için kısa santrifüjleyin, aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi ters transkripsiyon reaksiyon çözeltisini ekleyin.Karıştırmak için yavaşça pipetleyin.
1. Reaksiyon karışımının hazırlanması (20 μL hacim)
| Bileşenler | Hacim (μL) |
| Önceki adımın karışımı | 13 |
| 5×Tampon | 4 |
| dNTP Karışımı (10nmol/L) | 1 |
| Ters Transkriptaz (200 U/μL) | 1 |
| RNaz inhibitörü (40 U/μL) | 1 |
1.Reaksiyonu aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirin:
| Sıcaklık (°C) | Zaman |
| 25 °Ca | 5 dakika |
| 42 °Cb | 15-30 dakika |
| 85 °Cc | 5 dakika |
Notlar:
1 A.25°C'de 5 dakika inkübasyon yalnızca rastgele heksamerlerin kullanılması için gereklidir.Oligo (dT) kullanırken lütfen bu adımı atlayın18veya Gene Özel Astar.
2)b.Önerilen ters transkripsiyon sıcaklığı 42°C'dir. Karmaşık ikincil yapılara veya yüksek GC içeriğine sahip şablonlar için reaksiyon sıcaklığının 50-55°C'ye yükseltilmesi önerilir.
3) c.Ters transkriptazı etkisiz hale getirmek için 85°C'de 5 dakika süreyle ısıtma.
4) Ürün doğrudan PCR veya qPCR reaksiyonlarında kullanılabilir veya kısa süreli saklama için -20°C'de saklanabilir.Uzun süreli depolama için ürünlerin dilimlere ayrılması ve -80°C'de saklanması tavsiye edilir.Sık donma-çözülmeden kaçının.
5) Ürün tek adımlı RT-qPCR için uygundur, her 25μL reaksiyon sistemi için 10-20 U ters transkriptaz eklenmesi veya fiili duruma göre ters transkriptaz miktarını kademeli olarak artırmanız önerilir.
Notlar
1.Lütfen deney alanını temiz tutun;Çalışma sırasında temiz eldiven ve maske takılmalıdır.Deneyde kullanılan tüm sarf malzemeleri, RNaz kontaminasyonunu önlemek için RNaz içermemelidir.
2.RNA bozulmasını önlemek için tüm işlemler buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.
3. Ters transkripsiyonun yüksek verimliliğini sağlamak için yüksek kaliteli RNA örnekleri önerilir.
4.Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.
5. Güvenliğiniz için lütfen laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldivenlerle çalışın.
