mRNA Cap2'-O-Metiltransferaz

mRNA Cap 2'-O-metiltransferaz, aşı mRNA Cap 2'-O-Metiltransferaz genini taşıyan rekombinant E. coli türünden türetilmiştir.Bu enzim, RNA'nın 5' ucundaki başlık yapısına bitişik birinci nükleotidin 2'-O pozisyonuna bir metil grubu ekler. Enzim, başlıklı RNA'yı (başlık) metillemek için bir metil donörü olarak S-adenosilmetiyonini (SAM) kullanır. -0) kap-1 yapısına neden olur.

Cap1 yapısı transfeksiyon ve mikroenjeksiyon deneylerinde mRNA'nın ekspresyonunu geliştirerek translasyon verimliliğini artırabilir. Bu enzim özellikle substrat olarak m7GpppN başlıklı RNA gerektirir.5' ucunda pN, ppN, pppN veya GpppN bulunan RNA'yı kullanamaz.Başlıklı RNA, başlık analogu kullanılarak in vitro transkripsiyon yoluyla veya Vaccinia Capping Enzyme kullanılarak enzimatik kapatma yoluyla hazırlanabilir.

Bileşenler

mRNA Kap 2'-O-Metiltransferaz (50U/μL)

10×Kaplama Reaksiyon Tamponu

Depolamak

Depolama için -25 ～- 15°C （ Tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçının）

Depolama arabelleği

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25°C), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, %0.1 Triton X-100，%50 gliserol.

Birim tanımı

Bir birim, 37°C'de 1 saat içinde 10 pmol 80 nt başlıklı RNA transkriptini metillemek için gereken enzim miktarı olarak tanımlanır.

Kalite kontrol analizleri

eksonükleaz: 1μg λ-Hind III ile 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Metiltransferaz, 37 °C'de 16 saat boyunca DNA'yı sindirir, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği gibi hiçbir bozulma vermez.

Endonükleaz: 37°C'de 16 saat boyunca 1 μg λDNA ile 50 U mRNA Cap 2' -O-Metiltransferaz, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği üzere herhangi bir bozulma sağlamaz.

Nickaz: 16 saat boyunca 37°C'de 1μg pBR322 ile 50U mRNA Cap 2' -O-Metiltransferaz, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği üzere herhangi bir bozulma sağlamaz.

RNaz: 37°C'de 4 saat boyunca 1,6μg MS2 RNA ile 50U mRNA Cap 2´-O-Metiltransferaz, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği üzere herhangi bir bozulma sağlamaz.

E. koli DNA: 50U mRNA Cap 2' -O-Metiltransferaz varlığı açısından taranırE. koli spesifik primerlerle TaqMan qPCR kullanılarak genomik DNAE. koli 16S rRNA lokusu.E. koli genomik DNA kontaminasyonu =1E. koli genetik şifre.

Bakteriyel Endotoksin: LAL testi, Çin Farmakopesi IV 2020 baskısına göre, jel limit test yöntemi, genel kural (1143).Bakteriyel endotoksin içeriği =10 EU/mg olmalıdır.

Reaksiyon sistemi ve koşulları

1. Uygun miktarda Kapaklı RNA ve RNase içermeyen H2O'yu 1,5 mL mikrofüj tüpünde 16,0 µL'lik nihai hacme kadar birleştirin.

2. 65°C'de 5 dakika ısıtın, ardından 5 dakika buz banyosu yapın.

3. Aşağıdaki bileşenleri belirtilen sıraya göre ekleyin (Kapalı RNA'nın metilasyonu için)

10'dan az

*10× Sınırlandırma Reaksiyon Tamponu: 500 mM Tris-HCl(pH 8,0, 25°C), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. 37°C'de 1 saat inkübe edin (200 nt'den az hedef fragman için 2 saatlik inkübasyon önerilir).

Uygulamalar

Mikroenjeksiyon ve transfeksiyon deneyleri sırasında mRNA ifadesini geliştirmek.

Kullanıma ilişkin notlar

1. Reaksiyondan önce RNA saflaştırılıp nükleaz içermeyen suda çözülmeli, tüm çözeltiler EDTA ve iyon içermemelidir.

2. Transkriptin 5' ucundaki ikincil yapıyı çıkarmak için örnek RNA'nın reaksiyondan önce 5 dakika süreyle 65°C'de ısıtılması önerilir.Karmaşık 5' terminal yapısı için bu süre 10 dakikaya kadar uzatılabilir.