PNGaz F
Peptid-N-Glikosidaz F(PNGase F), neredeyse tüm N-bağlı oligosakaritleri glikoproteinlerden uzaklaştırmak için en etkili enzimatik yöntemdir.PNGaz F, N-bağlantılı glikoproteinlerden gelen yüksek mannoz, hibrit ve kompleks oligosakaritlerin en içteki GlcNAc ve asparajin kalıntıları arasında ayrılan bir amidazdır.
Başvuru
Bu enzim, proteinlerden karbonhidrat kalıntılarının uzaklaştırılmasında faydalıdır.
Hazırlık ve spesifikasyon
| Dış görünüş | Renksiz Sıvı |
| Protein saflığı | ≥%95 (SDS-PAGE'den) |
| Aktivite | ≥500.000 U/mL |
| Ekzoglikosidaz | Hiçbir etkinlik tespit edilemedi (ND) |
| Endoglikozidaz F1 | ND |
| Endoglikozidaz F2 | ND |
| Endoglikozidaz F3 | ND |
| Endoglikozidaz H | ND |
| Proteaz | ND |
Özellikler
| EC numarası | 3.5.1.52(Mikroorganizmadan rekombinant) |
| Moleküler ağırlık | 35 kDa (SDS-sayfa) |
| İzoelektrik nokta | 8. 14 |
| Optimum pH | 7.0-8.0 |
| Optimum sıcaklık | 65 °C |
| Substrat özgüllüğü | GlcNAc ve asparagin kalıntıları arasındaki glikosidik bağların ayrılması Şekil 1 |
| Tanıma siteleri | α1-3 fukoz içermediği sürece N-bağlantılı glikanlar Şekil 2 |
| Aktivatörler | DTT |
| inhibitör | GBF |
| Depolama sıcaklığı | -25 ~-15°C |
| Isı İnaktivasyonu | 1μL PNGase F içeren 20μL'lik bir reaksiyon karışımı, 75 °C'de 10 dakika süreyle inkübasyonla etkisiz hale getirilir. |
Şekil 1 PNGase F'nin substrat spesifikliği
Şekil 2 PNGase F'nin tanınması.
Dahili GIcNAc kalıntıları a1-3 fukoza bağlandığında PNGase F, N-bağlı oligosakkaritleri glikoproteinlerden ayıramaz.Bu modifikasyon bitkilerde ve bazı böcek glikoproteinlerinde yaygındır.
Cbileşenler
|
| Bileşenler | Konsantrasyon |
| 1 | PNGaz F | 50 ul |
| 2 | 10×Glikoprotein Denatüre Edici Tampon | 1000 ul |
| 3 | 10×GlikoTampon 2 | 1000 ul |
| 4 | %10 NP-40 | 1000 ul |
Birim tanımı
Bir birim(U), toplam 10 µL reaksiyon hacminde 37°C'de 1 saat içinde 10 µg denatüre RNase B'den karbonhidratın >%95'ini çıkarmak için gereken enzim miktarı olarak tanımlanır.
Reaksiyon koşulları
1. 1-20 µg glikoproteini deiyonize suyla çözün, 10 µl toplam reaksiyon hacmi elde etmek için 1 µl 10×Glikoprotein Denatüre Tamponu ve H2O (gerekiyorsa) ekleyin.
2.100°C'de 10 dakika inkübe edin, buz üzerinde soğutun.
3.2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl %10 NP-40 ekleyin ve karıştırın.
4.1-2 ul PNGase F ve H ekleyin2O (gerekirse) toplam 20 µl reaksiyon hacmi hazırlayın ve karıştırın.
5.Reaksiyonu 37°C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
6.SDS-PAGE analizi veya HPLC analizi için.
