Vaccinia Virüsü Kapatma Enzimi

Vaccinia virüsü kapatma enzimi, Vaccinia kapatma enzimi genlerini taşıyan rekombinant bir E. coli türünden türetilir.Bu tek enzim iki alt birimden (D1 ve D12) oluşur ve üç enzimatik aktiviteye sahiptir (D1 alt biriminde RNA trifosfataz ve guanililtransferaz ve D12 alt biriminde guanin metiltransferaz).Vaccinia virüsü Kapaklama Enzimi, 7-metilguanilat başlık yapısını (m7Gppp, Cap 0) RNA'nın 5' ucuna spesifik olarak ekleyebilen başlık yapısının oluşumunu katalize etmede etkilidir.Başlık yapısı (Cap 0) ökaryotlarda mRNA stabilizasyonunda, taşınmasında ve translasyonunda önemli bir rol oynar.RNA'nın enzimatik reaksiyonla kapatılması, in vitro transkripsiyon, transfeksiyon ve mikroenjeksiyon için RNA'nın stabilitesini ve translasyonunu önemli ölçüde artırabilen etkili ve basit bir yöntemdir.

Bileşenler

Vaccinia Virüsü Kapatma Enzimi (10 U/μL)

10×Kapaklama Tamponu

Depolama koşulları

Depolama için -25~- 15°C (Tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçının)

Depolama arabelleği

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, %0,1 Triton X-100, %50 gliserol.

Birim Tanımı

Bir ünite Vaccinia virüsü Kapaklama Enzimi, 37°C'de 1 saat içinde 10 pmol GTP'yi 80nt'lik bir transkripte dahil etmek için gereken enzim miktarı olarak tanımlanır.

Kalite kontrol

Eksonükleaz:1 μg λ-Hind III ile 10U Vaccinia virüsü Kapaklama Enzimi, 37 °C'de 16 saat boyunca DNA'yı sindirir, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği gibi hiçbir bozulma vermez.

Endonükleaz:16 saat boyunca 37°C'de 1μg λDNA ile 10U Vaccinia virüsü Kapaklama Enzimi, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği üzere herhangi bir bozulma sağlamaz.

Nickaz:16 saat boyunca 37°C'de 1 μg pBR322 ile 10U Vaccinia virüsü Kapaklama Enzimi, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği üzere herhangi bir bozulma sağlamaz.

RNaz:37°C'de 4 saat boyunca 1,6 μg MS2 RNA ile 10U Vaccinia virüsü Kapaklama Enzimi, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği üzere herhangi bir bozulma sağlamaz.

1.koli DNA'sı:10U Vaccinia virüsü Capping Enzimi, E. coli 16S rRNA lokusuna spesifik primerlerle TaqMan qPCR kullanılarak E. coli genomik DNA'sının varlığı açısından taranır.E. coli genomik DNA kontaminasyonu ≤1 E. coli genomudur.

2.Bakteriyel Endotoksin: LAL testi, Çin Farmakopesi IV 2020 baskısına göre, jel limit test yöntemi, genel kural (1143).Bakteriyel endotoksin içeriği ≤10 EU/mg olmalıdır.

Reaksiyon sistemi ve koşulları

1. Sınırlandırma Protokolü (reaksiyon hacmi: 20 μL)

Bu prosedür, 10μg RNA'nın (≥100 nt) kapatma reaksiyonuna uygulanabilir ve deneysel taleplere göre ölçeklendirilebilir.

I) 10μg RNA ve Nükleaz içermeyen H2O'yu 1,5 ml mikrofüj tüpünde 15,0 μL'lik nihai hacme kadar birleştirin.*10×Kapaklama Tamponu: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25°C, pH 8,0)

2) 65°C'de 5 dakika ısıtın, ardından 5 dakika buz banyosu yapın.

3) Aşağıdaki bileşenleri belirtilen sıraya göre ekleyin

*10×Kapama Tamponu: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25°C, pH8,0)

4) 37°C'de 30 dakika inkübe edin, RNA artık kapatılmıştır ve aşağı akış uygulamaları için hazırdır.

2. 5′ terminali etiketleme reaksiyonu (reaksiyon hacmi: 20 µL)

Bu protokol, 5' trifosfat içeren RNA'yı etiketlemek için tasarlanmıştır ve taleplere göre ölçeklendirilebilir.Etiket birleştirmenin verimliliği, RNA: GTP'nin molar oranından ve ayrıca RNA numunelerindeki GTP içeriğinden etkilenecektir.

1) Uygun miktarda RNA ve Nükleaz içermeyen H2O'yu 1,5 ml'lik bir mikrofüj tüpünde 14,0 µL'lik nihai hacme kadar birleştirin.

2) 65°C'de 5 dakika ısıtın, ardından 5 dakika buz banyosu yapın.

3)Aşağıdaki bileşenleri belirtilen sıraya göre ekleyin.

** GTP MIX, GTP'yi ve az sayıda işaretçiyi ifade eder.GTP konsantrasyonu için bkz.Not 3'e.

4) 37°C'de 30 dakika inkübe edin, RNA 5' ucu artık etiketlenmiştir ve aşağı akış için hazırdır

Uygulamalar

1. Çeviri deneyleri/in vitro çeviri öncesinde mRNA'nın kapatılması

2. mRNA'nın 5' ucunun etiketlenmesi

Kullanıma ilişkin notlar

1.Vaccinia Capping Enzyme ile inkübasyondan önce RNA çözeltisinin ısıtılması, transkriptin 5' ucundaki ikincil yapıyı ortadan kaldırır.Bilinen yüksek düzeyde yapılandırılmış 5' uçlu transkriptler için süreyi 60 dakikaya uzatın.

2. Kapatma reaksiyonları için kullanılan RNA, kullanımdan önce saflaştırılmalı ve nükleaz içermeyen su içinde süspanse edilmelidir.EDTA bulunmamalı ve çözelti tuz içermemelidir.

3. 5' ucunu etiketlemek için toplam GTP konsantrasyonu, reaksiyondaki mRNA'nın molar konsantrasyonunun yaklaşık 1-3 katı olmalıdır.

4. Reaksiyon sisteminin hacmi gerçek duruma göre büyütülebilir veya küçültülebilir.