5×Neoscript Hızlı RT-qPCR Premix plus-UNG
Kat No: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR), tek adımlı ters transkripsiyon ve kantitatif PCR (qRT-PCR) için uygun, oldukça stabil, tek tüplü, prob bazlı bir karışımdır.Primerlerin ve probların önceden karıştırılmasını destekler ve düşük sıcaklıkta uzun süre saklandıktan sonra stabil kalır.Test edilecek numune, ek tüp açma/pipetleme işlemine gerek kalmadan kullanım sırasında doğrudan eklenebilir.Bu ürün, örneğin sıcak başlangıçlı DNA polimeraz, M-MLV, ısıya duyarlı urasil DNA glikosilaz (TS-UNG), RNaz İnhibitörü, MgCl gibi bileşenler sağlar2, dNTP'ler (dTTP yerine dUTP ile) ve stabilizatörler.Genetiği değiştirilmiş hızlı amplifikasyon ters transkriptaz ve DNA polimeraz ile PCR amplifikasyonunun 20-40 dakika içerisinde tamamlanması mümkündür.Bu reaktif, anti-inhibitör amplifikasyon enzimi ve UNG enziminin karışık enzimlerini içeren qPCR için özel tampon kullanır.Bu nedenle, hedef genlerin iyi bir amplifikasyonunu elde edebilir ve PCR kalıntısı ve aerosol kirliliğinin neden olduğu yanlış amplifikasyonu önleyebilir.Bu reaktif, Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad ve Roche gibi üreticilerin çoğu floresan kantitatif PCR cihazıyla uyumludur.
Bileşen
1.25×Neoscript Hızlı RTaz/UNG Karışımı
2.5×Neoscript Hızlı RT Ön Karışım Tamponu (dUTP)
Depolama koşulları
Tüm bileşenler uzun süreli depolama için -20°C'de ve 3 aya kadar 4°C'de tutulmalıdır.Lütfen çözdürdükten sonra iyice karıştırın ve kullanmadan önce santrifüj edin.Sık donma-çözülmeden kaçının.
qRT-PCR Reaksiyon Sisteminin Hazırlanması
| Bileşenler | 25μLSistem | 50μLSistem | Nihai Konsantrasyon |
| 5×Neoscript Hızlı RT Ön Karışım Tamponu (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25×Neoscript Hızlı RTaz/UNG Karışımı | 1μL | 2μL | 1× |
| 25×Primer-Prob Karışımıa | 1μL | 2μL | 1× |
| Şablon RNA'sıb | – | – | – |
| ggh2O | 25μL'ye kadar | 50μL'ye kadar | – |
1) a. Primerin son konsantrasyonu genellikle 0,2μM'dir.Daha iyi sonuçlar için primer konsantrasyonu 0,2-1μM aralığında optimize edilebilir.Genellikle prob konsantrasyonu 0,1-0,3μM aralığında optimize edilebilir.
2) b.Hızlı bir PCR Prosedürü kullanıldığında, primerlerin ve probların konsantrasyonunun arttırılması daha iyi amplifikasyon sonuçlarına yol açabilir ve oranları buna göre optimize edilmelidir.
3) Farklı tipteki numuneler, farklı tip ve inhibitör içeriği ve hedef genin kopya sayısını içerir.Numune hacmi gerçek duruma göre değerlendirilmelidir.Gerekirse numunenin nükleaz içermeyen su veya TE Tamponu ile seyreltilmesini yapın.
Reaksiyon Ckoşullar
| Düzenli PCR Prosedürü | Hızlı PCR Prosedürü | ||||||
| Prosedür | Sıcaklık | Zaman | Döngü | Prosedür | Sıcaklık | Zaman | Döngü |
| Ters Transkripsiyon | 50°C | 10-20 dakika | 1 | Ters Transkripsiyon | 50°C | 5 dakika | 1 |
| Polimeraz Aktivasyon | 95°C | 1-5 dakika | 1 | Polimeraz Aktivasyon | 95°C | 30'lar | 1 |
| Denatürasyon | 95°C | 10-20'ler | 40-50 | Denatürasyon | 95°C | 1-3s | 40-50 |
| Tavlama Ve Eklenti | 56-64°C | 20-60'lar | Tavlama Ve Eklenti | 56-64°C | 3-20s | ||
Kalite kontrol
1.Fonksiyon tespiti: qPCR'nin duyarlılığı, özgüllüğü ve tekrarlanabilirliği.
2.Eksojen nükleaz aktivitesi yok: eksojen endonükleaz ve ekzonükleaz kirliliği yok.
Notlar
1.Hızlı DNA polimerazın amplifikasyon hızı 1kb/10s'den az değildir.Farklı PCR cihazları farklı ısıtma ve soğutma hızlarına, sıcaklık kontrol modlarına ve termal iletkenliğe sahiptir ve bu nedenle primer/prob konsantrasyonunuzun ve çalıştırma yönteminizin özel hızlı PCR cihazınızla kombinasyon halinde optimizasyonu önemlidir.
2.Bu ürün geniş uygulanabilirliğe sahiptir ve yüksek hassasiyetli moleküler teşhis için uygundur.Tavlama sıcaklığı düşük olan primerler veya 200 bp'nin üzerindeki uzun fragmanların amplifikasyonu için üç aşamalı PCR yöntemi önerilir.
3.Farklı amplikonlar farklı dUTP kullanım verimliliğine ve UNG'ye karşı farklı hassasiyete sahip olduğundan, UNG sistemi kullanılırken tespit hassasiyeti azalırsa reaktifler optimize edilmelidir.Gerektiğinde teknik destek için lütfen bizimle iletişime geçin.
4.Taşınan PCR ürünlerinin amplifikasyonunu önlemek amacıyla amplifikasyon için özel deney alanı ve pipet gereklidir.Eldivenlerle çalışın ve sık sık değiştirin ve amplifikasyondan sonra PCR tüpünü açmayın.
