EndoFree Plazmid Maxi Kiti

Depolama koşulları

RNaseA -30 ~ -15°C'de saklanmalı ve ≤0°C'de taşınmalıdır.

Endotoksin Temizleyici bir ay boyunca 2 ~ 8°C'de saklanabilir, uzun süreli depolama için -30 ~ -15°C'de saklanabilirve ≤0°C'de taşınır.

Diğer bileşenler oda sıcaklığında (15 ~25°C) saklanmalı ve oda sıcaklığında taşınmalıdır.

Bileşenler

RNaseA:10 mg/ml, RNA'yı uzaklaştırmak için kullanılır.

Tampon P1:bakteriyel süspansiyon tamponu, ilk kullanımdan önce Tampon P1'e RNazA ekleyin.

Tampon P2:bakteriyel lizis tamponu (SDS/NaOH içeren).

Tampon P4:nötrleştirici tampon.

Endotoksin Temizleyici:Ham plazmid ekstraktından endotoksini etkili bir şekilde çıkarın.

Tampon Şifresi:yıkama tamponu, ilk kullanımdan önce öngörülen miktarda etanol ekleyin.

Tampon TB:elüsyon tamponu.

FastPure DNA Maxi Sütunları:Plazmid DNA adsorpsiyon kolonları.

Toplama Tüpleri 50 ml:süzüntü toplama tüpleri.

Endotoksinsiz Toplama Tüpü:Plazmid DNA toplama tüpleri.

Hazırlanan Malzemeler

Mutlak etanol, izopropanol, 50 ml yuvarlak tabanlı santrifüj tüpleri ve 50 ml endotoksinsizsantrifüj tüpleri.

Uygulamalar

Bu ürün, 150 - 300 ml bakteri çözeltisinden plazmitlerin büyük ölçekli ekstraksiyonu için uygundur.gece boyunca kültürlendi.

Deney Süreci

1. Gece boyunca kültürlenen 150 – 200 ml (en fazla 300 ml) bakteri solüsyonunu alın ve 300 ml'de santrifüj edin.1 – 2 dakika boyunca yaklaşık 11.000 rpm (12.000 × g).Süpernatantı atın ve bakterileri toplayın.

Δ 50 ml'den fazla bakteriyel solüsyon toplandığında bakteriler, bakteriyel solüsyonun eklenmesi, santrifüjleme, süpernatantın atılması ve diğer adımların aynı 50 ml'lik tüpte toplanması yoluyla toplanabilir.

bir kaç sefer.

2. Santrifüje 7,5 ml Tampon P1 ekleyin (lütfen RNaseA'nın Tampon P1'e eklenip eklenmediğini kontrol edin)bakteri içeren tüpe boşaltın ve vorteks veya pipetleme yoluyla iyice karıştırın.

Δ Bu adımda bakterilerin tamamen yeniden süspanse edilmesi verim açısından kritik öneme sahiptir ve yeniden süspansiyondan sonra hiçbir bakteri kümesi olmamalıdır.İyice karıştırılmayan bakteri kümeleri varsa, bu durum lizizi etkileyerek verim ve saflığın düşmesine neden olur.Bakteriyel solüsyonun OD600'ü 0,65 ise, 150 ml bakteriyel solüsyondan ekstraksiyon yaparken 7,5 ml Buffer P1 kullanılması önerilir;OD600 0,75 olduğunda 8 ml Tampon P1 kullanılmalı ve Tampon P2 ve P4'ün hacimleri buna göre değiştirilmelidir.Bakteriyel solüsyonun hacmi 200 ml'ye çıkarılırsa,Tampon P1, P2 ve P4'ün hacmi orantılı olarak artırılır.

3. Adım 2'deki bakteri süspansiyonuna 7,5 ml Tampon P2 ekleyin ve 6 – 8 saat boyunca yavaşça yukarı ve aşağı doğru karıştırın.kez oda sıcaklığında 4 – 5 dakika inkübe edin.

Δ İyice karıştırmak için yavaşça ters çevirin.Vorteksleme genomik DNA fragmantasyonuna neden olacak ve bu da ekstrakte edilen plazmitte genomik DNA fragmanlarının oluşmasına neden olacaktır.Bu sırada çözelti viskoz ve yarı saydam hale gelir, bu da bakterilerin tamamen parçalandığını gösterir.Plazmidlerin yok edilmesini önlemek için süre 5 dakikayı geçmemelidir.Eğer çözüm berrak değilse çok fazla bakteri oluşmuş olabilir.Eksik lizis, bu nedenle bakteri miktarının uygun şekilde azaltılması gerekir.

4. Adım 3'teki bakteriyel süspansiyona 7,5 ml Tampon P4 ekleyin ve çözeltinin P2 Tamponunu tamamen nötralize etmesini sağlamak için hemen 6 – 8 kez yavaşça ters çevirin.Bu sırada beyaz topaklanma çökeltisi görünmelidir.10 – 15 dakika boyunca yaklaşık 11.000 rpm'nin (12.000 x g) üzerinde santrifüjleyin, süpernatantı yeni bir 50 ml'lik yuvarlak tabanlı santrifüj tüpüne (kendi hazırladığınız) dikkatlice pipetleyin veyüzen beyaz çökeltiyi aspire edin.

Δ Tampon P4'ü ekleyin ve iyice karıştırmak için hemen ters çevirin.Nötralizasyonu etkileyebilecek yerel çökeltilerin oluşmasını önlemek için beyaz çökelti çözelti boyunca eşit şekilde dağılıncaya kadar tüpü beklemeye bırakın.Santrifüjleme öncesinde homojen beyaz topak çökelti yoksa ve santrifüjleme sonrasında süpernatan berrak değilse, tüp5 dakika daha santrifüj edildi.

5. Adım 4'teki süpernatanta hacmin 0,1 katı (süpernatan hacminin %10'u, yaklaşık 2,2 ml) Endotoksin Scavenger ekleyin ve karıştırmak üzere ters çevirin.Çözeltiyi bir buz banyosuna yerleştirin veya kırılmış buza (veya buzdolabı dondurucusuna) 5 dakika boyunca çözelti bulanıktan berrak ve şeffaf hale gelene kadar (veya hareketsiz) yerleştirin.biraz bulanık) ve ara sıra birkaç kez karıştırın.

Δ Endotoksin Tutucu süpernatanta eklendikten sonra süpernatan bulanık hale gelecektir ancakbuz banyosunda soğutulduktan sonra süpernatan berrak (veya hafif bulanık) hale gelmelidir.

6. Süpernatant oda sıcaklığında (>25°C) 10 – 15 dakika bekletildikten sonra bulanık hale gelecektir.sıcaklığı oda sıcaklığına yükselir.Daha sonra süpernatantın karıştırılması için ters çevrilmesi gerekir.

Δ Oda sıcaklığı daha düşükse veya ekstraksiyon süresini kısaltmak istiyorsanız süpernatan, 37 ~ 42°C su banyosunda 5 – 10 dakika süreyle inkübe edilebilir ve bir sonraki adım, süpernatandan sonra gerçekleştirilebilir.bulanık hale gelir.

7. Fazın ayrılması için süpernatantı oda sıcaklığında (sıcaklık >25°C olmalıdır) 10 dakika boyunca yaklaşık 11.000 rpm'de (12.000 x g) santrifüjleyin.Üst sulu faz DNA'yı içerirken alt mavi yağlı faz katmanı endotoksin ve diğer safsızlıkları içerir.AktarDNA içeren sulu fazı yeni bir tüpe aktarın veyağlı tabakayı atın.

Δ Santrifüjleme sırasındaki sıcaklık 25°C'nin üzerinde olmalıdır çünkü etkin faz ayrımı gerçekleşmez.sıcaklığın çok düşük olması durumunda meydana gelir.

Δ Faz ayrımı etkili değilse, santrifüjleme sıcaklığı 30°C'ye ayarlanabilir veSantrifüj süresi 15 dakikaya çıkarılabilir.

Δ Endotoksin ve diğer yabancı maddeleri içerdiğinden mavi yağlı tabakayı emmeyin.

Mekanizma

Yeniden Süspansiyon Lizis Nötralizasyonu

◇ 7,5 ml Tampon P1 ekleyin

◇ 7,5 ml Tampon P2 ekleyin

◇ 7,5 ml Tampon P4 ekleyin

Endotoksin giderme

◇ Endotoksin Scavenger'ın süpernatan hacminin 0,1 katı ekleyin

Bağlama ve Yıkama

◇ İzopropanol hacminin 0,5 katı ekleyin

◇ 10 ml Tampon PW ekleyin