M-MLV Neoscript Ters Transkriptaz
Neoscript Ters Transkriptaz, Moloney murin lösemi virüsü kökenli M-MLV geninin mutasyon taraması ve E.coli'deki ekspresyonu ile elde edilen bir ters transkriptazdır.Enzim, RNase H aktivitesini ortadan kaldırır, daha yüksek sıcaklık toleransına sahiptir ve yüksek sıcaklıkta ters transkripsiyon için uygundur.Bu nedenle RNA üst düzey yapısının ve spesifik olmayan faktörlerin cDNA sentezi üzerindeki olumsuz etkilerinin ortadan kaldırılmasına yardımcı olur ve daha yüksek stabiliteye ve ters transkripsiyon sentez yeteneğine sahiptir.Enzim daha yüksek stabiliteye ve ters transkripsiyon sentez yeteneğine sahiptir.
Bileşenler
1.200 U/μL Neoscript Ters Transkriptaz
2.5 × Birinci Şerit Tamponu (isteğe bağlı)
* 5 × First-Strand Buffer dNTP içermez, lütfen reaksiyon sistemini hazırlarken dNTP'leri ekleyin
Önerilen Uygulama
1.Tek adımlı qRT-PCR.
2.RNA virüsü tespiti.
Saklama Durumu
-20°C'de uzun süreli saklama için, kullanımdan önce iyice karıştırılmalıdır, sık donma-çözülmeden kaçınılmalıdır.
Birim Tanımı
Bir ünite, poli(A)•oligo(dT) kullanılarak 37°C'de 10 dakikada 1 nmol dTTP içerir25şablon/astar olarak.
Kalite kontrol
1.SDS-PAGE elektroforetik saflığı %98'den fazladır.
2.Amplifikasyon hassasiyeti, partiden partiye kontrol, kararlılık.
3.Eksojen nükleaz aktivitesi yok, eksojen endonükleaz veya ekzonükleaz kontaminasyonu yok
İlk Zincir Reaksiyon Çözümü için Reaksiyon Kurulumu
1.Reaksiyon karışımının hazırlanması
| Bileşenler | Hacim |
| Oligo(dT)12-18 Astar veya Rastgele AstarA Veya Gene Özel Primerlerb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Şablon RNA'sı | Toplam RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNaz içermeyen dH2O | 10 μL'ye kadar |
Notlar:a/b: Lütfen deneysel ihtiyaçlarınıza göre farklı primer türlerini seçin.
2.65°C'de 5 dakika ısıtın ve 2 dakika boyunca buz üzerinde hızla soğutun.
3.Aşağıdaki bileşenleri toplam 20μL hacme kadar yukarıdaki sisteme ekleyin ve yavaşça karıştırın:
| Bileşenler | Hacim (μL) |
| 5 × Birinci Şerit Tamponu | 4 |
| Neoscript Ters Transkriptaz (200 U/μL) | 1 |
| RNaz inhibitörü (40 U/μL) | 1 |
| RNaz içermeyen dH2O | 20 μL'ye kadar |
4. Lütfen reaksiyonu aşağıdaki koşullara göre gerçekleştirin:
(1) Rastgele Primer kullanılırsa reaksiyon 25°C'de 10 dakika süreyle ve ardından 50°C'de 30~60 dakika süreyle gerçekleştirilmelidir;
(2) Oligo dT veya spesifik primerler kullanılıyorsa reaksiyon 50°C'de 30~60 dakika süreyle gerçekleştirilmelidir.
5.Neoscript Ters Transkriptazı etkisiz hale getirmek ve reaksiyonu sonlandırmak için 5 dakika boyunca 95°C'de ısıtın.
6.Ters transkripsiyon ürünleri doğrudan PCR reaksiyonunda ve floresan kantitatif PCR reaksiyonunda kullanılabilir veya -20°C'de uzun süre saklanabilir.
PCRRtepki:
1.Reaksiyon karışımının hazırlanması
| Bileşenler | Konsantrasyon |
| 10 × PCR Tamponu (dNTP içermez, Mg²+ içermez) | 1× |
| dNTP'ler (her biri dNTP 10 mM) | 200 uM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polimeraz (5U/μL) | 2-2,5 Ü |
| Astar 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Astar 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| ŞablonA | ≤%10 İlk Zincir Reaksiyon Çözümü (2 μL) |
| ggh2O | 50 μL'ye kadar |
Notlar:a: Çok fazla birinci zincir reaksiyon solüsyonu eklenirse PCR reaksiyonu inhibe edilebilir.
2.PCR Reaksiyon Prosedürü
| Adım | Sıcaklık | Zaman | Döngüler |
| Ön denatürasyon | 95°C | 2-5 dakika | 1 |
| Denatürasyon | 95°C | 10-20 saniye | 30-40 |
| Tavlama | 50-60°C | 10-30 saniye | |
| Eklenti | 72°C | 10-60 saniye |
Notlar
1.42°C~55°C aralığında ters transkripsiyon sıcaklığı optimizasyonu için uygundur.
2.Daha iyi stabiliteye sahiptir ve yüksek sıcaklıkta ters transkripsiyon amplifikasyonu için uygundur.Ek olarak, RNA'nın karmaşık yapısal bölgelerinden verimli bir şekilde geçmek için de uygundur.Ayrıca otek adımlı multipleks floresan kantitatif RT-PCR tespiti için uygundur.
3.Çeşitli PCR amplifikasyon enzimleriyle iyi uyumluluk ve yüksek hassasiyetli RT-PCR reaksiyonları için uygundur.
4.Yüksek hassasiyetli tek adımlı floresan kantitatif RT-PCR reaksiyonu için uygundur, düşük şablon konsantrasyonunun tespit oranını etkili bir şekilde artırır.
5.CDNA kütüphanesi yapımına uygundur.
