Rnaz İnhibitörü
Fare RNaz inhibitörü, E.coli'den eksprese edilen ve saflaştırılan bir rekombinant fare RNaz inhibitörüdür.Kovalent olmayan bağlanma yoluyla RNase A, B veya C'ye 1:1 oranında bağlanır, böylece üç enzimin aktivitesini inhibe eder ve RNA'yı bozulmadan korur.Ancak Aspergillus kaynaklı RNaz 1, RNaz T1, S1 Nükleaz, RNaz H veya RNaz'a karşı etkili değildir.Murin RNaz inhibitörü, RT-PCR, RT-qPCR ve IVT mRNA ile test edildi ve çeşitli ticari Ters transkriptazlar, DNA polimerazlar ve RNA polimerazlarla uyumluydu.
İnsan RNaz inhibitörleriyle karşılaştırıldığında, fare RNaz inhibitörü, inhibitörün etkisizleşmesine neden olan oksidasyona karşı oldukça duyarlı iki sistein içermez.Bu, onu düşük DTT konsantrasyonlarında (1 mM'den az) stabil hale getirir.Bu özellik, yüksek DTT konsantrasyonlarının reaksiyona ters olduğu reaksiyonlarda (örn. Gerçek zamanlı RT-PCR) kullanıma uygun hale getirir.
Auygulama
Bu ürün, RNA bozulmasını önlemek için RNaz müdahalesinin mümkün olduğu herhangi bir deneyde yaygın olarak kullanılabilir, örneğin:
1.İlk cDNA dizisinin sentezi, RT-PCR, RT-qPCR, vb.
2.RNA'yı in vitro transkripsiyon/translasyon sırasında bozulmadan korur (örn. in vitro viral replikasyon sistemi).
3.RNA ayırma ve saflaştırma sırasında RNaz aktivitesinin inhibisyonu.
Depolama koşulları
Ürün -25~-15°C sıcaklıkta 2 yıl süreyle saklanabilir.
Depolama arabelleği
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25°C), 8 mM DTT ve %50 gliserol.
Birim tanımı
5ng ribonükleaz A'nın aktivitesini %50 oranında inhibe etmek için gereken fare RNaz inhibitörünün miktarı bir birim (U) olarak tanımlandı.
Proteinin moleküler ağırlığı
Fare RNaz inhibitörünün moleküler ağırlığı 50 kDa'dır.
Kalite kontrol
eksonükleaz Aktivite:
1 μg λ -Hind III içeren 40 U murin RNaz inhibitörü, 37°C'de 16 saat boyunca DNA'yı sindirir, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği gibi hiçbir bozulma vermez.
Endonükleaz Aktivitesi:
16 saat boyunca 37°C'de 1μ g λ DNA'ya sahip 40 U fare RNaz inhibitörü, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği üzere herhangi bir bozulma sağlamaz.
Nickleme Aktivite:
16 saat boyunca 37°C'de 1μ g pBR322 ile 40U fare RNaz inhibitörü, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği üzere herhangi bir bozulma sağlamaz.
RNaz Aktivite:
37°C'de 4 saat süreyle 1,6 μ g MS2 RNA'lı 40U fare RNaz inhibitörü, agaroz jel elektroforezi ile belirlendiği üzere herhangi bir bozulma sağlamaz.
E.koli DNA'sı:
40 U fare RNaz inhibitörü, E. coli 16S rRNA lokusuna spesifik primerlerle TaqMan qPCR kullanılarak E. coli genomik DNA'sının varlığı açısından taranır.E. coli genomik DNA kontaminasyonu ≤ 0,1 pg/40 U'dur.
Nnots
1. Şiddetli salınım veya karıştırma enzim inaktivasyonuna yol açacaktır.
2. Bu inhibitörün optimum sıcaklık aralığı 25-55 °C idi ve 65 °C ve üzerinde etkisiz hale getirildi.
3. RNaz H, RNaz 1 ve RNaz T1'in aktiviteleri, fare RNaz inhibitörü tarafından inhibe edilmedi.
4. RNaz aktivitesinin inhibisyonu geniş bir pH aralığında bulundu (pH 5-9'un tamamı aktifti) ve en yüksek aktivite pH 7-8'de gözlendi.
5. Ribonükleazlar tipik olarak denatüre edici koşullar altında aktiviteyi koruduğundan, bir ribonükleaz ile kompleks oluşturan RNaz İnhibitör moleküllerinin denatüre edilmesinden kaçınmak için dikkatli olunmalıdır.Aktif ribonükleazın salınmasını önlemek için, 50 °C'nin üzerindeki sıcaklıklardan ve yüksek konsantrasyonlarda üre veya diğer denatüre edici ajanlardan kaçınılmalıdır.
