RTL Ters Transkriptaz
RTL ters transkriptaz, 3'→5' ekzonükleaz aktivitesinden yoksun ve RNase H aktivitesine sahip, RNA şablonuna bağımlı bir DNA polimerazdır.Bu enzim, özellikle RT-LAMP (döngü aracılı izotermal amplifikasyon) için birinci iplikçik cDNA sentezine uygulanabilen tamamlayıcı bir DNA iplikçiğini sentezlemek için RNA'yı bir şablon olarak kullanabilir.RTL ters transkriptaz 1.0 ile karşılaştırıldığında hassasiyet önemli ölçüde artar, termal stabilite daha güçlüdür ve 65°C'deki reaksiyon daha stabildir.RTL ters transkriptaz (gliserol içermeyen), liyofilize preparasyonlar, liyofilize RT-LAMP reaktifleri vb. hazırlamak için kullanılabilir.
Birim Tanımı
Bir ünite, şablon-astar olarak poli(A)•oligo(dT)25 kullanılarak 50°C'de 20 dakikada asitle çökelebilen malzemeye 1 nmol dTTP katar.
Bileşenler
| Bileşen | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Ters Transkriptaz (Gliserolsüz) (15U/μL) | 0,1 mL | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL Tampon | 1,5 mL | 4×1,5 mL | 5×10 ml |
| MgS04 (100mM) | 1,5 mL | 2×1,5 mL | 3×10 mL |
Saklama Durumu
0°C'nin altında nakliye ve -25°C~-15°C'de saklanmalıdır.
Kalite kontrol
- Artık AktiviteEdonnükleaz:1 μg λDNA ve 15 ünite RTL2.0 içeren 50 μL'lik bir reaksiyon, 37°C'de 16 saat inkübe edildi, jel elektroforezi ile negatif kontrol ile aynı modeli gösterir.
- Artık Aktiviteeksonükleaz:1 μg HindⅢ sindirilmiş λDNA ve 16 saat boyunca 37°C'de inkübe edilmiş 15 ünite RTL2.0 içeren 50 μL'lik bir reaksiyon, jel elektroforezi ile negatif kontrol ile aynı modeli gösterir.
- Artık AktiviteNickaz:1 µg aşırı sarmal pBR322 ve 4 saat süreyle 37°C'de inkübe edilen 15 ünite RTL2.0 içeren 50 μL'lik bir reaksiyon, jel elektroforezi ile negatif kontrol ile aynı modeli gösterir.
- Artık AktiviteRNaz:0,48 μg MS2 RNA ve 4 saat boyunca 37°C'de inkübe edilen 15 ünite RTL2.0 içeren 10 μL'lik bir reaksiyon, jel elektroforezi ile negatif kontrol ile aynı modeli gösterir.
- E. coli gDNA:Şununla ölçüldü:E.colispesifik HCD tespit kitleri，15 ünite RTL2.0, 1'den az içerirE. coligenetik şifre.
Reaksiyon Kurulumu
cDNA Sentezi Protokolü
| Bileşenler | Hacim |
| Şablon RNA a | isteğe bağlı |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) veya Rastgele Astar karışımı(60uM) | 2 μL |
| dNTP Karışımı (her biri 10 mM) | 1 μL |
| RNaz İnhibitörü (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Ters Transkriptaz 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL Tampon | 2 μL |
| Nükleaz içermeyen Su | 20 μL'ye kadar |
Notlar:
1) Önerilen Toplam RNA dozu 1ng~1μg’dır
2) Önerilen mRNA dozu 50ng~100ng idi
Termo-Bisiklete binme Bir rutin için koşullar reaksiyon:
| Sıcaklık (°C) | Zaman |
| 25 °Ca | 5 dakika |
| 55 °C | 10 dakikab |
| 80 °C | 10 dakika |
Notlar:
1) Rastgele Primer Karışımı kullanılıyorsa, 25°C'de bir inkübasyon adımı.
2) Hedef primer karışımı kullanılıyorsa, 55°C'de 10~30 dakika süreyle inkübasyon adımı.
RT-LAMP Protokolü
| Bileşenler | Hacim | Nihai Konsantrasyon |
| Şablon RNA'sı | isteğe bağlı | ≥10 kopya |
| dNTP Karışımı (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP Primerleri (25×) | 1 μL | 1,6 uM |
| F3/B3 Primerler (25×) | 1 μL | 0,2 uM |
| DöngüF/DöngüB Primerleri (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNaz İnhibitörü (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaksiyon |
| RTL Ters Transkriptaz 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/Reaksiyon |
| Bst V2 DNA Polimeraz (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksiyon |
| MgS04 (100mM) | 1,5 μL | 6 mM (Toplam 8 mM) |
| 10×HC RTL Tampon (veya 10×HC Bst V2 Tampon) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Nükleaz içermeyen Su | 25 μL'ye kadar | - |
Notlar:
1) Vorteksleyerek karıştırın ve toplamak için kısa süre santrifüj edin.1 saat boyunca 65°C'de sabit sıcaklıkta inkübasyon.
2) İki tampon birlikte çalışabilir ve aynı bileşime sahiptir.
Notlar
1.Bu ürün -20 °C'de saklandığında beyaz bir katı oluşturacaktır.-20°C'den çıkarın ve yaklaşık 10 dakika boyunca buza koyun.Eritildikten sonra çalkalanıp karıştırılarak kullanılabilir.
2.CDNA ürünü -20°C veya -80°C'de saklanabilir veya PCR reaksiyonu için hemen kullanılabilir.
3.RNaz kontaminasyonunu önlemek için lütfen deney alanını temiz tutun ve çalışma sırasında temiz eldiven ve maske takın.
