DNA Ekstraksiyon Mini Kiti
Bu kit, çeşitli TAE veya TBE agaroz jel konsantrasyonlarından 70 bp – 20 kb DNA fragmanlarını geri kazanabilen optimize edilmiş tampon sistemi ve silika jel kolon saflaştırma teknolojisini kullanır.DNA adsorpsiyon kolonu, yüksek tuz koşullarında DNA'yı özel olarak adsorbe edebilir.Ayrıca kit, PCR ürünlerinden, enzimatik reaksiyon sistemlerinden veya diğer yöntemlerle elde edilen ham DNA ürünlerinden DNA fragmanlarını doğrudan saflaştırabilir ve proteinler, diğer organik bileşikler, inorganik tuz iyonları ve oligonükleotid primerleri gibi safsızlıkları giderebilir.Arıtmanın 10-15 dakika içerisinde tamamlanmasını sağlayabilir.Saflaştırılmış DNA, ligasyon, transformasyon, enzim sindirimi, in vitro transkripsiyon, PCR, sekanslama, mikroenjeksiyon vb. için doğrudan kullanılabilir.
Depolama koşulları
-15 ~ -25°C'de saklayın ve oda sıcaklığında taşıyın.
Bileşenler
| Bileşenler | (100 rxns) |
| Tampon GSYH | 80 ml |
| Tampon GW | 2 × 20 ml |
| Elüsyon Tamponu | 20 mi |
| FastPure DNA Mini Sütunları-G | 100 |
Tampon GSYH:DNA bağlama tamponu.
Tampon GW'si:Yıkama tamponu;Kullanmadan önce şişede belirtilen hacim kadar mutlak etanol ekleyin.
Elüsyon Tamponu:Elüsyon.
FastPure DNA Mini Sütunları-G:DNA adsorpsiyon kolonları.
Toplama Tüpleri 2 ml:Filtrat için toplama tüpleri.
Hazırlanan Malzemeler
1,5 ml sterilize edilmiş tüpler, mutlak etanol ve izopropanol (DNA fragmanı ≤100 bp olduğunda, 1 hacim ekleyin
izopropanolden 1 hacim jele kadar), su banyosu.
Deney Süreci
Kullanmadan önce Buffer GW'yi etikette belirtildiği gibi seyreltmek için 80 ml etanol ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın.
Mekanizma
1. PCR reaksiyon çözümü
Jel ekstraksiyon şeması: Eşit hacimli Tampon GDP PCR reaksiyon çözeltisi kurtarma şeması ekleyin:Hacim arabelleğinin 5 katı ekleyin
2. GSYİH Jelin hacmini hesaplayın(100 μ100 mg'a eşittir)
Jeli çözün
3. 50 ~ 55'te ön ısıtma°C
4. Cilt Yıkama
300 μL Tampon GDP ekleyin*
700 μL Tampon GW ekleyin
700 μL Tampon GW ekleyin
5. Elüsyon
20 – 30μL Elüsyon Tamponu veya deiyonize su ekleyin
Notlar* Bu adım olmadan PCR reaksiyonu sıvısının geri kazanımı
Jel ekstraksiyon programı
1. DNA fragmanlarını parçalara ayırmak için DNA elektroforezinden sonra, DNA fragmanının tek şeridini UV ışığı altında agaroz jelden çıkarın.Jelin görünen nemini emmek için emici kağıt kullanılması ve ekstra agarozu mümkün olduğunca çıkararak jel diliminin boyutunu en aza indirmeniz önerilir.Hacmini hesaplamak için jel dilimini (mikrosantrifüj tüpü olmadan) tartın: 100 mg jel diliminin hacmi, yoğunluğun 1g/ml olduğu varsayılarak yaklaşık 100 μL'dir.
2. Eşit hacimde Tampon GDP ekleyin, 50~55°C'de 7-10 dakika inkübe edin (jel boyutuna göre, inkübasyon süresini jel tamamen eriyene kadar ayarlayın).İnkübasyon sırasında tüpü 2 kez ters çevirin.
Δ 1-3 hacim Tampon GDP'nin eklenmesi, DNA kurtarma verimliliğini etkilemeyecektir.Geri kazanılacak DNA fragmanı <100 bp ise 3 hacim Tampon GDP'nin eklenmesi gerekir;Jel dilimi tamamen çözündüğünde 1 hacim izopropanol ekleyin ve iyice karıştırın, ardından bir sonraki adıma geçin.
3. Örneği tüpün dibine getirmek için kısa bir süre santrifüjleyin, FastPure DNA Mini Columns-G'yi 2 ml Toplama Tüplerine yerleştirin, maksimum 700 μL'lik solüsyonu günde bir kez dikkatlice aktarın.
Filtrasyon kolonlarına kadar geçen sürede, 12.000 rpm'de (13.800 X g) 30-60 saniye boyunca santrifüjleyin.
4. Süzüntüyü atın ve kolona 300 μL Tampon GDP ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin, 12.000 rpm'de (13.800 X g) 30-60 saniye santrifüj edin.
5. Süzüntüyü atın ve kolona 700 μL Tampon GW ekleyin (önceden mutlak etanol eklenip eklenmediğini kontrol edin!), 12.000 rpm'de (13.800 X g) 30-60 saniye santrifüj edin.
Δ Lütfen adsorpsiyon kolonu duvarının etrafına Buffer GW ekleyin veya Buffer GW arka kapağını ekleyin ve tüp duvarına yapışan tuzun tamamen temizlenmesine yardımcı olmak için 2 – 3 kez baş aşağı karıştırın.
6. 5. adımı tekrarlayın.
Δ Tampon GW ile iki kez yıkama, tuzun tamamen uzaklaştırılmasını sağlayabilir ve sonraki deneyler üzerindeki etkiyi ortadan kaldırabilir.
7. Süzüntüyü atın ve boş sütunu 12.000 rpm'de (13.800 X g) 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
8. Kolonu temiz bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, kolon membranının merkezine 20 - 30 μL Elüsyon Tamponu ekleyin, 2 dakika inkübe edin ve ardından 1 dakika boyunca 12.000 rpm'de (13.800 X g) santrifüjleyin.Sütunu atın ve elde edilen DNA'yı -20°C'de saklayın.
Δ Adım 8'deki süpernatantı tekrar elüsyon için kolona aktarmak ve Elüsyon Tamponunu 55°C'ye (DNA fragmanı >3 kb olduğunda) önceden ısıtmak, kurtarma verimliliğini arttırmaya yardımcı olabilir.
PCR ürünleri kurtarma programı
Bu protokol, PCR ürünlerinden, enzimatik reaksiyon sisteminden ve diğer DNA ham ürünlerinden (genetik DNA dahil) DNA parçalarını saflaştırmak için geçerlidir.Bu çözüm, çeşitli nükleotidleri, primerleri, primer dimerlerini, tuz moleküllerini, enzimleri ve diğer safsızlıkları etkili bir şekilde giderebilir.
1. PCR ürünlerini, enzimatik reaksiyon solüsyonunu ve diğer ham DNA ürünlerini kısaca santrifüjleyin.Pipetle hacimlerini tahmin edin ve sterilize edilmiş 1,5 ml veya 2 ml'lik bir tüpe aktarın.Hacim 100 μL'ye ulaşana kadar ddH2O ekleyin;yüksek konsantrasyonlu genomik DNA için ise ddH2O ile 300 μL'ye seyreltmek, kurtarma verimliliğini artırmaya yardımcı olacaktır.
2. 5 hacim Tampon GDP ekleyin, ters çevirerek veya vorteksleyerek iyice karıştırın.İlgili DNA fragmanı >100 bp ise ilave 1,5 hacim (numuneler + Tampon GDP) etanolün eklenmesi gerekir.
3. Kolonu tekrar toplama tüpüne yerleştirin, karışımı kolona aktarın, 12.000 rpm'de (13.800 xg) 30 – 60 saniye boyunca santrifüjleyin.Karışık çözeltinin hacmi >700 μL ise, adsorpsiyon sütununu tekrar toplama tüpüne koyun, kalan çözeltiyi adsorpsiyon sütununa aktarın ve 12.000 rpm'de (13.800 × g) 30 – 60 saniye santrifüj edin.
4. Bir sonraki performans, 08-1/Gel ekstraksiyon programının 5 – 8. adımlarına atıfta bulunur.
Uygulamalar
Çeşitli konsantrasyonlarda TAE veya TBE agaroz jeli;PCR ürünleri, enzimatik reaksiyon sistemleri veya çeşitli yöntemlerle elde edilen diğer ham DNA ürünleri.Kurtarılan parçalar arasında değişiyordu70 bp-20 kb.
Notlar
Yalnızca araştırma amaçlıdır.Teşhis prosedürlerinde kullanılmaz.
1. Kullanmadan önce Tampon GW'yi etikette belirtildiği gibi seyreltmek için 80 ml etanol ekleyin, oda sıcaklığında saklayın.
2. Tampon GDP'nin düşük sıcaklıkta depolama sırasında çökeltilmesi kolaysa, kullanımdan önce bir süre oda sıcaklığında tutulabilir.Gerekirse, çökelti tamamen eriyene kadar 37°C'lik su banyosunda önceden ısıtılabilir ve karıştırıldıktan sonra kullanılabilir.
3. Su banyosu sıcaklığını önceden 50 ~55°C'ye ayarlayın.
4. 08-1/Jel ekstraksiyon programı adım 1'de, jel diliminin boyutunun en aza indirilmesi, çözünme süresini önemli ölçüde azaltacak ve geri kazanım verimliliğini artıracaktır (Doğrusallaştırılmış DNA, sürekli olarak yüksek sıcaklığa maruz bırakıldığında kolayca hidrolize olur).Ultraviyole ışık DNA hasarına neden olabileceğinden DNA jelini uzun süre UV'ye maruz bırakmayın.
5. Jeli 08-1/Jel ekstraksiyon programı adım 2'de tamamen çözün, aksi halde DNA geri kazanım verimliliği ciddi şekilde etkilenecektir.
6. DNA elüsyon verimliliğini artırmaya yardımcı olan Elüsyon Tamponunu veya ddH2O'yu 55°C'ye önceden ısıtın.DNA'nın 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5 elüentinde saklanması önerilir.
