Hotstart Taq DNA Polimeraz
Hot Start Taq DNA Polimeraz (Antikor modifikasyonu), 5'→3' polimeraz aktivitesine ve 5' flap endonükleaz aktivitesine sahip olan, Thermus Aquaticus YT-1'den elde edilen, sıcak başlangıçlı, termostabil bir DNA polimerazdır.Sıcak başlangıçlı Taq DNA polimerazı, termolabil Taq antikorları tarafından modifiye edilen bir Taq DNA polimerazıdır.Antikor modifikasyonu PCR'nin özgüllüğünü, duyarlılığını ve verimini arttırdı.
Bileşenler
| Bileşen | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq Tamponu | 4×1 ml | 4×10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq DNA Polimeraz (Antikor modifiyeli) (5 U/μL) | 0,1 mL | 1 ml | 5 ml | 10×5 mL |
Uygulamalar
10 mM Tris-HCl (25°C'de pH 7,4), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiyotreitol, %0,5 Tween20, %0,5 IGEPALCA-630 ve %50 Gliserol.
Saklama Durumu
0°C'nin altında nakliye ve -25°C~-15°C'de saklanmalıdır.
Birim Tanımı
Bir birim, 75°C'de 30 dakika içinde asitte çözünmeyen malzemeye 15 nmol dNTP katan enzim miktarı olarak tanımlanır.
Kalite kontrol
1.Endonucleaz Aktivitesi:20 U enzimin 4 μg pUC19 DNA ile 4 saat boyunca 37°C'de inkübasyonu, jel elektroforezi ile belirlendiği gibi DNA'da saptanabilir bir bozulmayla sonuçlanmadı.
2.5 kb Lambda PCR:200 uM dNTP'ler ve 0,2 uM primerlerin varlığında 1,25 birim Taq DNA Polimeraz ile 5 ng Lambda DNA'nın 25 döngü PCR amplifikasyonu, beklenen 5 kb ürünle sonuçlanır.
3.Eksonükleaz Aktivitesi:Minimum 12,5 U Taq DNA Polimeraz içeren 50 ul reaksiyonun 10 nmol 5'-FAM oligonükleotid ile 37°C'de 30 dakika süreyle inkübasyonu, tespit edilebilir bir bozulma sağlamaz.
4.RNaz Aktivitesi:20 U enzim içeren 10 uL reaksiyonun 1 μg RNA transkriptiyle 2 saat boyunca 37°C'de inkübasyonu, jel elektroforezi ile belirlendiği gibi RNA'da saptanabilir bir bozulmayla sonuçlanmadı.
5.Isı İnaktivasyonu:HAYIR.
Reaksiyon Sistemi
| Bileşenler | Hacim |
| Şablon DNA'sıa | isteğe bağlı |
| 10 μM İleri Astar | 0,5 μL |
| 10 μM Ters Astar | 0,5 μL |
| dNTP Karışımı (her biri 10 mM) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq Tamponu | 5 μL |
| Taq DNA PolimerazB(5U/μL) | 0,125 μL |
| Nükleaz içermeyen su | 25 μL'ye kadar |
Notlar:
1 A.
| DNA | Miktar |
| genomik | 1 ng-1 μg |
| Plazmid veya Viral | 1 pg-1 ng |
2)b.Taq DNA Polimerazın optimal konsantrasyonu, özel uygulamalarda 5-50 birim/mL (0,1-0,5 birim/25 µL reaksiyon) arasında değişebilir.
Termal bisiklet protokolü
PCR
| Adım | Sıcaklık(°C) | Zaman | Döngüler |
| İlk denatürasyona | 95°C | 1-3 dakika | - |
| Denatürasyon | 95°C | 15-30 sn | 30-35 Döngü |
| TavlamaB | 45-68°C | 15-60 sn | |
| Eklenti | 68°C | 1kb/dak | |
| Son Uzatma | 68°C | 5 dakika | - |
Notlar:
1) Çoğu amplifikasyon için 95°C'de 1 dakikalık bir başlangıç denatürasyonu yeterlidir.Zor şablonlar için 95°C'de 2-3 dakikalık daha uzun bir denatürasyon önerilir.Koloni PCR'de, 95°C'de ilk 5 dakikalık denatürasyon önerilir.
2) Tavlama adımı tipik olarak 15-60 saniyedir.Tavlama sıcaklığı primer çiftinin Tm'sine bağlıdır ve tipik olarak 45-68°C'dir.
