Proteinaz K NGS (toz)
Kat No: HC4507A
NGS Proteaz K, yüksek enzim aktivitesine ve geniş substrat spesifikliğine sahip stabil bir serin proteazdır. Enzim, tercihen hidrofobik amino asitlerin, kükürt içeren amino asitlerin ve aromatik amino asitlerin C-terminaline bitişik ester bağlarını ve peptit bağlarını ayrıştırır.Bu nedenle sıklıkla proteinleri kısa peptidlere parçalamak için kullanılır.NGS Proteaz K, Asp'ye sahip tipik bir serin proteazdır.39-Onun69-Sör224serin proteazlara özgü katalitik üçlüdür ve katalitik merkez, Ca2 ile çevrilidir.2+Stabilizasyon için bağlanma bölgeleri, daha geniş koşullar altında yüksek enzim aktivitesinin korunması.
Şartname
| Dış görünüş | Beyaz ila kirli beyaz amorf toz, liyofilize |
| Spesifik aktivite | ≥40U/mg katı |
| DNaz | Hiçbiri algılanmadı |
| RNaz | Hiçbiri algılanmadı |
| Biyolojik yük | ≤50CFU/g katı |
| Nükleik asit kalıntısı | <5pg/mg katı |
Özellikler
| Kaynak | Tritirachium albümü |
| EC numarası | 3.4.21.64(Tritirachium albümünden rekombinant) |
| Moleküler ağırlık | 29kDa (SDS-PAGE) |
| İzoelektrik nokta | 7.81 Şekil 1 |
| Optimum pH | 7,0-12,0 (Hepsi yüksek aktivite gerçekleştirir) Şekil 2 |
| Optimum sıcaklık | 65°C Şekil 3 |
| pH Kararlılığı | pH 4,5-12,5 (25°C,16 saat) Şekil 4 |
| Termal kararlılık | 50°C'nin altında (pH 8,0, 30 dakika) Şekil 5 |
| Depolama kararlılığı | 12 ay boyunca 25°C'de saklanır Şekil.6 |
| Aktivatörler | SDS, üre |
| İnhibitörler | Diizopropil florofosfat;benzilsülfonil florür |
Depolama koşulları
Liyofilize tozu -25~-15 °C'de uzun süre ışıktan uzakta saklayın;Çözündükten sonra, ışıktan 2-8°C'de kısa süreli depolama veya ışıktan -25~-15°C'de uzun süreli depolama için uygun hacme bölün.
Önlemler
Kullanırken veya tartarken koruyucu eldiven ve gözlük takın ve kullanımdan sonra iyice havalandırın.Bu ürün ciltte alerjik reaksiyonlara ve ciddi göz tahrişine neden olabilir.Solunması halinde alerjiye, astım semptomlarına veya nefes darlığına neden olabilir.Solunum yolu tahrişine neden olabilir.
Birim tanımı
Bir ünite NGS Proteaz K, standart belirleme koşulları altında kazeini 1 μmol L-tirozine hidrolize etmek için gereken enzim miktarı olarak tanımlanır.
Reaktiflerin hazırlanması
| Reaktif | Üretici firma | Katalog |
| Kazein tekniksığır sütünden | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm KimyasalReaktif Co., Ltd. | 10019762 |
| Hayır2PO4·2 saat2O | Sinopharm KimyasalReaktif Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm KimyasalReaktif Co., Ltd. | 20040618 |
| Triklorasetik asit | Sinopharm KimyasalReaktif Co., Ltd. | 80132618 |
| Sodyum asetat | Sinopharm KimyasalReaktif Co., Ltd. | 10018818 |
| Asetik asit | Sinopharm KimyasalReaktif Co., Ltd. | 10000218 |
| HC1 | Sinopharm KimyasalReaktif Co., Ltd. | 10011018 |
| Sodyum karbonat | Sinopharm KimyasalReaktif Co., Ltd. | 10019260 |
| Folin-fenol | Sangon Biyoteknoloji (Şangay)Limited Şirketi. | A500467-0100 |
| L-tirozin | Sigma | 93829 |
Reaktif I:
Substrat: Sığır sütü çözeltisinden %1 Kazein: 1 g sığır sütü kazeini, 50 ml 0,1 M sodyum fosfat çözeltisi içinde eritilir, pH 8,0, su banyosunda 65-70 °C'de 15 dakika ısıtılır, karıştırılır ve çözülür, suyla soğutulur, şu şekilde ayarlanır: sodyum hidroksit pH 8.0'a getirilir ve 100 ml'ye seyreltilir.
Reaktif II:
TCA çözeltisi: 0,1M trikloroasetik asit, 0,2M sodyum asetat ve 0,3M asetik asit (ard arda 1,64g trikloroasetik asit + 1,64g sodyum asetat + 1,724mL asetik asit tartın, 50mL deiyonize su ekleyin, HCl ile pH 4,03'e ayarlayın ve seyreltin 100ml).
Reaktif III:
0,4 m sodyum karbonat çözeltisi (4,24 g susuz sodyum karbonat ağırlığında ve 100 mL suda çözülür)
Reaktif IV:
Folin fenol reaktifi: deiyonize suyla 5 kez seyreltin.
Reaktif V:
Enzim seyreltici: 0,1 M sodyum fosfat çözeltisi, pH 8,0.
Reaktif VI:
L-tirozin standart çözeltisi: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirozin, 0,2M HC1 ile çözündürüldü.
Prosedür
1. UV-Vis spektrofotometresini açın ve fotometrik ölçümü seçin.
2. Dalga boyunu 660nm olarak ayarlayın.
3. Su banyosunu açın, sıcaklığı 37°C'ye ayarlayın, sıcaklığın 3-5 dakika boyunca değişmemesini sağlayın.
4. 0,5 mL substratı 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde 37°C su banyosunda 10 dakika boyunca önceden ısıtın.
5. 0,5 mL seyreltilmiş enzim solüsyonunu önceden ısıtılmış santrifüj tüpüne 10 dakika boyunca ekstrakte edin.Enzim seyrelticisini boş grup olarak ayarlayın.
6. Reaksiyonun hemen ardından 1,0 mL TCA reaktifini ekleyin.İyice karıştırın ve su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
7. Reaksiyon solüsyonunu santrifüjleyin.
8. Aşağıdaki bileşenleri belirtilen sıraya göre ekleyin.
| Reaktif | Hacim |
| Süpernatan | 0,5 ml |
| 0.4M Sodyum karbonat | 2,5 ml |
| Folin fenol reaktifi | 0,5 ml |
9. 37°C sıcaklıktaki su banyosunda 30 dakika inkübe etmeden önce iyice karıştırın.
10. OD660OD olarak belirlendi1;boş kontrol grubu: OD'yi belirlemek için enzim çözeltisinin yerine enzim seyrelticisi kullanılır660OD olarak2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-tirozin standart eğrisi: 0,5 mL farklı konsantrasyonda L-tirozin çözeltisi, 2,5 mL 0,4M Sodyum karbonat, 5 mL santrifüj tüpünde 0,5 mL Folin fenol reaktifi, 30 dakika boyunca 37°C'de inkübe edin, OD'yi tespit edin660farklı L-tirozin konsantrasyonu için, Y=kX+b standart eğrisi elde edildi; burada Y, L-tirozin konsantrasyonu, X, OD'dir.600.
Hesaplama
2: Reaksiyon çözeltisinin toplam hacmi (mL)
0,5: Enzim çözeltisinin hacmi (mL)
0,5: Kromojenik belirlemede kullanılan reaksiyon sıvısı hacmi (mL)
10: Reaksiyon süresi (dak)
Df: Çoklu seyreltme
C: Enzim konsantrasyonu (mg/mL)
Rakamlar
Şekil 1 DNA kalıntısı
| Örnek | Cadde C4 | Nükleik asit Kurtarma(pg/mg) | İyileşmek(%) | Toplam Nükleer Asit ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | %83 | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNA İçermeyen H2O | Belirsiz | — | — | — |
Şekil 2 Optimum pH
Şekil 3 Optimum sıcaklık
Şekil 4 pH Kararlılığı
Şekil 5 Termal kararlılık
Şekil 6 25°C'de depolama stabilitesi
