Superstart qPCR Premix plus-UNG
Kat No: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG, özellikle liyofilizasyon işlemleri için geliştirilmiş, prob bazlı tespit kullanan Gerçek Zamanlı PCR kalitatif ve kantitatif reaksiyonları için tasarlanmış özel bir reaktiftir.Taq enzim aktivitesi oda sıcaklığında mühürlenmiş olan yeni bir sıcak başlangıç enzimi Hotstart Taq plus (DG) içerir ve düşük sıcaklık koşulları altında primerin spesifik olmayan tavlaması veya primer dimer oluşumunun neden olduğu spesifik olmayan amplifikasyonu etkili bir şekilde inhibe eder ve böylece iyileştirme sağlar. amplifikasyon reaksiyonunun özgüllüğü.Bu reaktif, hızlı bir sıcak başlatma elde etmek için optimize edilmiş bir qPCR'ye özgü tampon ve UNG/dUTP anti-kontaminasyon sistemi kullanır ve qPCR reaksiyonlarının verimliliğini ve hassasiyetini büyük ölçüde artırır.Çok çeşitli kantitasyon alanlarında iyi standart eğriler elde edebilir ve kantifikasyonu doğru bir şekilde gerçekleştirerek, artık PCR ürünleri veya aerosol kontaminasyonunun neden olduğu hatalı pozitif amplifikasyonu etkili bir şekilde önleyebilir.Bu reaktif, Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad ve Roche gibi üreticilerin çoğu floresan kantitatif PCR cihazıyla uyumludur ve liyofilize formda iyi stabilite sergiler.
Reaktif bileşimi
1. 5×HotstartPremix artı-UNG (Mg2+ücretsiz) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4×liyoprotektan (isteğe bağlı)
Depolama koşulları
-20°C'de uzun süreli depolama;4°C'de 3 aya kadar saklanabilir.Kullanmadan önce iyice karıştırın veTekrarlanan donma ve çözülmelerden kaçının.
Bisiklet Protokolü
| Prosedür | Sıcaklık | Zaman | Döngü |
| Sindirim | 50°C | 2 dakika | 1 |
| Polimeraz aktivasyonu | 95°C | 1~5 dakika | 1 |
| Denatüre | 95°C | 10~20 sn | 40-50 |
| Tavlama ve Uzatma | 56~64°C | 20~60 sn | 40-50 |
qPCR Sıvı Reaksiyon Sistemisap Hazırlama
|
Kompozisyon |
25μL Hacim |
50μL Hacim |
Nihai Konsantrasyon |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+ücretsiz) (DG) | 5μL | 10μL | 1× |
| 250mM MgCl2 | 0,45μL | 0,9μL | 4,5 mM |
| 4×liyoprotektan1 | 6,25μL | 12,5μL | 1× |
| 25×Primer-Prob Karışımı2 | 1μL | 2μL | 1× |
| Şablon DNA'sı3 | —— | —— | —— |
| ggh2O | 25μL'ye kadar | 50μL'ye kadar | —— |
1. Primerler için 0,2μM'lik nihai konsantrasyon genellikle iyi sonuçlar verir;Reaksiyon performansı zayıf olduğunda primer konsantrasyonunu gerektiği gibi 0,2-1μM aralığında ayarlayın.Prob konsantrasyonu tipik olarak optimum kombinasyonları bulmak için gradyan deneyleri yoluyla 0,1-0,3μM aralığında optimize edilir.
2. Farklı şablon türlerinde bulunan hedef genlerin kopya sayısı değişir;Gerekirse optimum şablon ekleme miktarını belirlemek için gradyan seyreltme yapılabilir.
3. Bu sistem liyofilize edilebilir;Müşteriler bu sistemi donma-kurutma gereksinimi olmadan kullandıklarında, seçici olarak 4×liyoprotektan eklenebilir; eğer dondurularak kurutulmuş ürünler gerekiyorsa, sıvı reaktifler aşaması ürün performans doğrulaması sırasında, liyofilize sistem bileşenleriyle tutarlılığı sağlamak için 4×liyoprotektan eklemelidir. ve etkileri.
Sistem kullanıldığındadondurarak kurutmak için, sistem as takip etme:
| Kompozisyon | 25µL Reaksiyon Sistemi |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+ücretsiz) (DG) | 5μL |
| 250mM MgCl2 | 0,45μL |
| 4×liyoprotektan | 6,25μL |
| 25×Primer-Prob Karışımı | 1μL |
| ggh2O | 18~20μL'ye kadar |
* Dondurarak kurutma için başka sistemlere ihtiyaç duyulursa lütfen ayrıca danışın.
Liyofilizasyon Prosesiss
| Prosedür | Sıcaklık | Zaman | Durum | Basınç |
| Ön dondurma | 4°C | 30 dk | Tutmak |
1 atm |
| -50°C | 60 dakika | Soğutma | ||
| -50°C | 180 dakika | Tutmak | ||
| Birincil Kurutma | -30°C | 60 dakika | Isıtma |
Üstün Vakum |
| -30°C | 70 dakika | Tutmak | ||
| İkincil Kurutma | 25°C | 60 dakika | Isıtma |
Üstün Vakum |
| 25°C | 300 dakika | Tutmak |
2. Yukarıdaki liyofilizasyon işlemi yalnızca referans amaçlıdır.Farklı ürün tipleri ve farklı dondurarak kurutucular farklı parametrelere sahiptir, dolayısıyla gerçek değerlere göre ayarlamalar yapılabilir.Kullanım sırasındaki koşullar.
3. Farklı liyofilize edilmiş ürün parti büyüklükleri için farklı liyofilizasyon işlemleri uygun olabilir.ürünler olduğundan, büyük ölçekli üretim için kullanıldığında yeterli test doğrulamasının yapılması gerekir.
Liyofilize kullanma talimatıtoz
1. Liyofilize tozu kısa bir süre santrifüjleyin;
2. Liyofilize toza nükleik asit şablonu ekleyin ve 25μL'ye kadar su ekleyin;
3. Santrifüj yoluyla iyice karıştırın ve makinede çalıştırın.
Kalite kontrol:
1. Fonksiyonel testler: qPCR'nin duyarlılığı, özgüllüğü, tekrarlanabilirliği.
2. Eksojen nükleaz aktivitesi yok, ekzojen endo/ekzonükleaz kontaminasyonu yok.
Teknik Bilgiler:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG, 1~5 dakika içinde hızlı sıcak başlatmayı mümkün kılan yeni bir sıcak başlatma enzimi kullanır;Özel tampon formülasyonu sayesinde multipleks floresan kantitatif PCR reaksiyonlarına uygundur.
2. Floresan kantitatif PCR limit tespitinin hassasiyetini önemli ölçüde artıran, amplifikasyon eğrilerinin normalizasyonunu sağlayan, floresans değerinin düşük konsantrasyonlu şablonlarda belirgin bir iyileşme elde etmesini sağlayan, yüksek hassasiyetli floresan kantitatif PCR tespit reaktifleri olarak uygun olan daha yüksek spesifikliğe sahiptir.
3. Tavlama sıcaklığı daha düşük olan veya 200bp'den uzun fragmanlara sahip primerler için 3 aşamalı yöntem önerilir.
4. dUTP'nin kullanım verimliliği ve UNG enzimine duyarlılık farklı hedef genler için farklılık gösterir; dolayısıyla UNG sisteminin kullanılması tespit duyarlılığında bir azalmaya yol açıyorsa reaksiyon sistemi ayarlanmalı ve optimize edilmelidir.Teknik destek gerekiyorsa lütfen firmamızla iletişime geçin.
5. Amplifikasyondan önce ve sonra özel alanları ve pipetleri kullanın, işlem sırasında eldiven giyin ve bunları sık sık değiştirin;Numunelerin PCR ürünleriyle kontaminasyonunu en aza indirmek için PCR tamamlandıktan sonra reaksiyon tüpünü açmayın.
