Proteinaz K mNGS (sıvı)
Proteinaz K, geniş substrat spesifikliğine sahip stabil bir serin proteazdır.Deterjanların varlığında bile doğal haldeki birçok proteini bozar.Kristal ve moleküler yapı çalışmalarından elde edilen kanıtlar, enzimin aktif bölge katalitik üçlüsüne (Asp) sahip subtilisin ailesine ait olduğunu göstermektedir.39-Onun69-Sör224).Baskın bölünme bölgesi, bloke edilmiş alfa amino gruplarına sahip alifatik ve aromatik amino asitlerin karboksil grubuna bitişik peptit bağıdır.Geniş özgüllüğü nedeniyle yaygın olarak kullanılır.Bu proteinaz K, mNGS için özel olarak tasarlanmıştır.Diğer proteinaz K ile karşılaştırıldığında, aynı enzimatik performansla daha az nükleik asit kontaminasyonu içerir, bu da aşağı yönde mNGS uygulamasını daha iyi sağlayabilir.
Depolama koşulları
2 yıl boyunca 2-8°C
Şartname
| Dış görünüş | Renksiz ila açık kahverengi sıvı |
| Aktivite | ≥800 U/ml |
| Protein Konsantrasyonu | ≥20 mg/ml |
| Nickaz | Hiçbiri algılanmadı |
| DNaz | Hiçbiri algılanmadı |
| RNaz | Hiçbiri algılanmadı |
Özellikler
| EC numarası | 3.4.21.64(Tritirachium albümünden rekombinant) |
| İzoelektrik nokta | 7.81 |
| Optimum pH | 7.0- 12.0 Şekil 1 |
| Optimum sıcaklık | 65°C Şekil 2 |
| pH stabilitesi | pH 4,5- 12,5 (25°C, 16 saat) Şekil 3 |
| Termal kararlılık | 50°C'nin altında (pH 8,0, 30 dakika) Şekil 4 |
| Depolama kararlılığı | 25 °C'de 12 ay boyunca %90'ın üzerinde aktivite |
| Aktivatörler | SDS, üre |
| İnhibitörler | Diizopropil florofosfat;fenilmetilsülfonil florür |
Uygulamalar
1. Genetik tanı kiti
2. RNA ve DNA ekstraksiyon kitleri
3. Protein olmayan bileşenlerin dokulardan ekstraksiyonu, DNA gibi protein safsızlıklarının parçalanmasıaşılar ve heparinin hazırlanması
4. Darbeli elektroforez ile kromozom DNA'sının hazırlanması
5. Batı lekesi
6. Enzimatik glikosile edilmiş albümin reaktifleri in vitro tanı
Önlemler
Kullanırken veya tartarken koruyucu eldiven ve gözlük takın ve kullanımdan sonra iyice havalandırın.Bu ürün ciltte alerjik reaksiyonlara ve ciddi göz tahrişine neden olabilir.Solunması halinde alerjiye, astım semptomlarına veya nefes darlığına neden olabilir.Solunum yolu tahrişine neden olabilir.
Birim tanımı
Bir birim (U), 1 μmol üretmek üzere kazeini hidrolize etmek için gereken enzim miktarı olarak tanımlanır.Aşağıdaki koşullar altında dakikada tirozin.
Reaktiflerin hazırlanması
Reaktif I: 1 g süt kazeini, 50 ml 0,1 M sodyum fosfat çözeltisi (pH 8,0) içinde çözüldü, 65-70°C suda 15 dakika inkübe edildi, karıştırıldı ve çözüldü, su ile soğutuldu, sodyum hidroksit ile pH 8,0'a ayarlandı ve sabit hacim 100ml.
Reaktif II: 0,1M trikloroasetik asit, 0,2M sodyum asetat, 0,3M asetik asit.
Reaktif III: 0,4M Na2CO3çözüm.
Reaktif IV: Forint reaktifi saf su ile 5 kez seyreltilir.
Reaktif V: Enzim seyreltici: 0,1 M sodyum fosfat çözeltisi (pH 8,0).
Reaktif VI: tirozin çözeltisi: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml 0,2 ile çözülmüş tirozinM HCI.
Prosedür
1. 0,5 ml reaktif I önceden 37°C'ye ısıtılır, 0,5 ml enzim çözeltisi eklenir, iyice karıştırılır ve 37°C'de inkübe edilir.10 dakika boyunca 37°C.
2. Reaksiyonu durdurmak için 1 ml reaktif II ekleyin, iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca inkübasyona devam edin.
3. Reaksiyon solüsyonunu santrifüjleyin.
4. 0,5 ml süpernatan alın, 2,5 ml reaktif III, 0,5 ml reaktif IV ekleyin, iyice karıştırın ve 37°C'de inkübe edin30 dakika boyunca.
5. OD660OD olarak belirlendi1;boş kontrol grubu: Enzimin yerine 0,5 ml reaktif V kullanılırOD'yi belirlemek için çözüm660OD olarak2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirozin standart eğrisi: 0,5 mL farklı konsantrasyonda L-tirozin çözeltisi, 2,5 mL Reaktif III, 5 mL santrifüj tüpünde 0,5 mL Reaktif IV, 30 dakika boyunca 37°C'de inkübe edin, OD'yi tespit edin660farklı L-tirozin konsantrasyonu için, Y=kX+b standart eğrisi elde edildi; burada Y, L-tirozin konsantrasyonu, X, OD'dir.600.
Hesaplama
2: Reaksiyon çözeltisinin toplam hacmi (mL)
0,5: Enzim çözeltisinin hacmi (mL)
0,5: Kromojenik belirlemede kullanılan reaksiyon sıvısı hacmi (mL)
10: Reaksiyon süresi (dak)
Df: Çoklu seyreltme
C: Enzim konsantrasyonu (mg/mL)
Referanslar
1. Wieger U ve Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U ve Hilz H. Biochem.Biyofiz.Res.İletişim(1971);44:513.
3. Hilz, H.ve diğerleri,Avro.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4.Sambrook Jet al., Moleküler Klonlama: Bir Laboratuar El Kitabı, 2. Baskı, Cold Spring HarborLaboratuvar Basını, Cold Spring Harbor (1989).
Rakamlar
incir.1 Optimum pH
100 mM tampon çözeltisi: pH6.0-8.0, Na-fosfat;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glisin-NaOH.Enzim konsantrasyonu:1mg/mL
Şekil 2 Optimum sıcaklık
20 mM K-fosfat tamponu pH 8,0'da reaksiyon.Enzim konsantrasyonu: 1 mg/mL
Şekil 3 pH istikrar
25°C, 50 mM tampon çözeltisiyle 16 saatlik işlem: pH 4,5-5,5, Asetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HC1.pH 9,0-12,5, Glisin-NaOH.Enzim konsantrasyonu: 1 mg/mL
Şekil 4 Termal istikrar
50 mM Tris-HCl tamponu, pH 8,0 ile 30 dakikalık işlem.Enzim konsantrasyonu: 1 mg/mL
Şekil 5 Depolama stabilty at 25°C
