Vahşi Taq DNA Polimeraz
Taq DNA Polimeraz, 5'→3' polimeraz aktivitesine ve 5' flap endonükleaz aktivitesine sahip olan, Thermus Aquaticus YT-1'den elde edilen termostabil bir DNA polimerazdır.
Bileşenler
| Bileşen | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× Taq Tamponu | 2×1 ml | 2×10 ml | 2×50 ml | 5×200 mL |
| Taq DNA Polimeraz (5 U/μL) | 0,1 mL | 1 ml | 5 ml | 5×10 ml |
Saklama Durumu
0°C'nin altında nakliye ve -25°C~-15°C'de saklanmalıdır.
Birim Tanımı
Bir birim, 75°C'de 30 dakika içinde asitte çözünmeyen malzemeye 15 nmol dNTP katan enzim miktarı olarak tanımlanır.
Kalite kontrol
1.Protein Saflık Testi (SDS-PAGE):Taq DNA polimerazın saflığı SDS-PAGE analiziyle ≥%95 olarak belirlendi.
2.Endonucleaz Aktivitesi:37°C'de 16 saat süreyle 1 μg λDNA'ya sahip minimum 5 U Taq DNA polimeraz, belirlendiği gibi tespit edilebilir bir bozulmayla sonuçlanmaz.
3.Eksonükleaz Aktivitesi:37°C'de 16 saat süreyle 1 μg λ -HindⅢ sindirilmiş DNA'ya sahip minimum 5 U Taq DNA polimeraz, belirlendiği gibi tespit edilebilir bir bozulmayla sonuçlanmaz.
4.Nickaz Aktivitesi:37°C'de 16 saat süreyle 1 μg pBR322 DNA'ya sahip minimum 5 U Taq DNA polimeraz, belirlendiği gibi tespit edilebilir bir bozulmayla sonuçlanmaz.
5.RNaz Aktivitesi:37°C'de 16 saat süreyle 1,6 μg MS2 RNA'lı minimum 5 U Taq DNA polimeraz, belirlendiği gibi saptanabilir bir bozulmayla sonuçlanmaz.
6.E. coliDNA:5 U Taq DNA polimeraz, E. coli 16S rRNA lokusuna spesifik primerlerle TaqMan qPCR kullanılarak E. coli genomik DNA'sının varlığı açısından taranır.E. coli genomik DNA kontaminasyonu ≤1 Kopyadır.
7.PCR Amplifikasyonu (5,0 kb Lambda DNA)- 25 döngü PCR amplifikasyonu için 5 ünite Taq DNA Polimeraz ile 5 ng Lambda DNA içeren 50 µL reaksiyon, beklenen 5,0 kb ürünle sonuçlanır.
Reaksiyon Kurulumu
| Bileşenler | Hacim |
| Şablon DNA'sıa | isteğe bağlı |
| 10 μM İleri Astar | 1 μL |
| 10 μM Ters Astar | 1 μL |
| dNTP Karışımı (her biri 10 mM) | 1 μL |
| 10×Taq Tamponu | 5 μL |
| Taq DNA PolimerazB | 0,25 μL |
| Nükleaz içermeyen su | 50 μL'ye kadar |
Notlar:
1) Farklı şablonların optimal reaksiyon konsantrasyonu farklıdır.Aşağıdaki tablo 50 µL reaksiyon sisteminin önerilen şablon kullanımını göstermektedir.
| DNA | Miktar |
| genomik | 1 ng-1 μg |
| Plazmid veya Viral | 1 pg-1 ng |
2) Taq DNA Polimerazın optimal konsantrasyonu, özel uygulamalarda 0,25 µL~1 µL arasında değişebilir.
Reaksiyonprogramı
| Adım | Sıcaklık(°C) | Zaman | Döngüler |
| İlk denatürasyona | 95°C | 5 dakika | - |
| Denatürasyon | 95°C | 15-30 sn | 30-35 Döngü |
| TavlamaB | 60°C | 15 saniye | |
| Eklenti | 72°C | 1kb/dak | |
| Son Uzatma | 72°C | 5 dakika | - |
Notlar:
1) Başlangıç denatürasyon koşulu çoğu amplifikasyon reaksiyonu için uygundur ve şablon yapısının karmaşıklığına göre değiştirilebilir.Şablon yapısı karmaşıksa, ilk denatürasyon etkisini iyileştirmek için ön denatürasyon süresi 5 – 10 dakikaya kadar uzatılabilir.
2) Tavlama sıcaklığının, genellikle primerin Tm değerinden 3 ~ 5 ° C daha düşük olarak ayarlanan primerin Tm değerine göre ayarlanması gerekir;Karmaşık şablonlar için, etkili amplifikasyon elde etmek amacıyla tavlama sıcaklığını ayarlamak ve uzatma süresini uzatmak gerekir.
