Evrensel SYBR GREEN qPCR Premiks (Mavi)
Kat Numarası: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (Boya Bazlı), yüksek hassasiyet ve özgüllük ile karakterize edilen 2x gerçek zamanlı kantitatif PCR amplifikasyonu için bir ön çözümdür, mavi renktedir ve numune ekleme izleme etkisine sahiptir.Çekirdek bileşen Taq DNA polimeraz, numune hazırlama sırasında primer tavlaması nedeniyle spesifik olmayan amplifikasyonu etkili bir şekilde engellemek için antikor sıcak başlatmayı kullanır.Aynı zamanda formül, PCR reaksiyonunun amplifikasyon verimliliğini artırmak ve farklı GC içeriklerine (%30 ~ 70) sahip genlerin amplifikasyonunu eşitlemek için teşvik edici faktörleri ekler, böylece kantitatif PCR geniş bir kantitatif ortamda iyi bir doğrusal ilişki elde edebilir. bölge.Bu ürün, çoğu qPCR cihazına uygulanabilen özel ROX Pasif Referans Boyası içerir.ROX konsantrasyonunu farklı aletlerde ayarlamak gerekli değildir.Reaksiyon sistemini amplifikasyona hazırlamak için yalnızca primerlerin ve şablonların eklenmesi gereklidir.
Bileşenler
Evrensel Mavi qPCR Ana Karışımı
Depolama koşulları
Ürün buz paketleri ile gönderilir ve -25°C~-15°C sıcaklıkta 18 ay süreyle saklanabilir.Reaksiyon sistemini saklarken veya hazırlarken güçlü ışık ışınımından kaçınmak gerekir.
Şartname
| Konsantrasyon | 2× |
| Algılama yöntemi | SYBR |
| PCR yöntemi | qPCR |
| Polimeraz | Taq DNA polimeraz |
| Örnek türü | DNA |
| Uygulama ekipmanı | Çoğu qPCR cihazı |
| Ürün tipi | Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR için SYBR ön karışımı |
| (Uygulama)'ya uygula | Gen İfadesi |
Talimatlar
1.Reaksiyon Sistemi
| Bileşenler | Volom(μL) | Volom(μL) | Nihai Konsantrasyon |
| Evrensel SYBR GREEN qPCR Premiksi | 25 | 10 | 1× |
| İleri Astar (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2μmol/L |
| Ters Astar (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2μmol/L |
| DNA | X | X | |
| ggh2O | 50'ye kadar | 20'ye kadar | - |
[Not]: Şiddetli çalkalamadan kaynaklanan aşırı kabarcıkları önlemek için kullanmadan önce iyice karıştırın.
a) Primer konsantrasyonu: Nihai primer konsantrasyonu 0,2μmol/L'dir ve uygun şekilde 0,1 ile 1,0μmol/L arasında da ayarlanabilir.
b) Şablon konsantrasyonu: Şablon seyreltilmemiş cDNA stok çözeltisi ise kullanılan hacim, qPCR reaksiyonunun toplam hacminin 1/10'unu geçmemelidir.
c) Şablon seyreltme: cDNA stok çözeltisinin 5-10 kat seyreltilmesi önerilir.Amplifikasyonla elde edilen Ct değeri 20-30 döngü olduğunda eklenen optimum şablon miktarı daha iyidir.
d) Reaksiyon sistemi: Hedef gen amplifikasyonunun etkinliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için 20μL veya 50μL kullanılması önerilir.
e) Sistem hazırlığı: Lütfen süper temiz tezgahta hazırlayın ve nükleaz kalıntısı olmayan uçları ve reaksiyon tüplerini kullanın;Filtre kartuşlu uçların kullanılması tavsiye edilir.Çapraz kontaminasyon ve aerosol kontaminasyonundan kaçının.
2.Reaksiyon programı
Standart Program
| Döngü adımı | Sıcaklık | Zaman | Döngüler |
| İlk denatürasyon | 95°C | 2 dakika | 1 |
| Denatürasyon | 95°C | 10 saniye | 40 |
| Tavlama/Uzatma | 60°C | 30 saniye★ | |
| Erime eğrisi aşaması | Cihaz Varsayılanları | 1 | |
Hızlı Program
| Döngü adımı | Sıcaklık | Zaman | Döngüler |
| İlk denatürasyon | 95°C | 30 saniye | 1 |
| Denatürasyon | 95°C | 3 saniye | 40 |
| Tavlama/Uzatma | 60°C | 20 saniye★ | |
| Erime eğrisi aşaması | Cihaz Varsayılanları | 1 | |
[Not]: Hızlı program, genlerin büyük çoğunluğu için uygundur ve standart programlar, bireysel karmaşık ikincil yapı genleri için denenebilir.
a) Tavlama sıcaklığı ve süresi: Lütfen primer ve hedef genin uzunluğuna göre ayarlayın.
b) Floresan sinyal edinimi (★): Lütfen deneysel prosedürü cihazın kullanım talimatlarındaki gereksinimlere göre ayarlayın.
c) Erime eğrisi: Cihazın varsayılan programı normal şekilde kullanılabilir.
3. Sonuç Analizi
Kantitatif deneyler için en az üç biyolojik kopya gerekliydi.Reaksiyondan sonra amplifikasyon eğrisinin ve erime eğrisinin doğrulanması gerekir.
3.1 Amplifikasyon eğrisi:
Standart amplifikasyon eğrisi S şeklindedir.Kantitatif analiz, Ct değeri 20 ile 30 arasına düştüğünde en doğru sonucu verir. Ct değeri 10'un altındaysa şablonun seyreltilmesi ve testin yeniden yapılması gerekir.Ct değeri 30-35 arasında olduğunda amplifikasyon verimliliğini artırmak ve sonuç analizinin doğruluğunu sağlamak için şablon konsantrasyonunu veya reaksiyon sisteminin hacmini artırmak gerekir.Ct değeri 35'ten büyük olduğunda test sonuçları genin ifadesini niceliksel olarak analiz edemez ancak niteliksel analiz için kullanılabilir.
3.2 Erime eğrisi:
Erime eğrisinin tek zirvesi, reaksiyon özgüllüğünün iyi olduğunu ve niceliksel analizin yapılabileceğini gösterir;erime eğrisi çift veya çoklu tepe noktaları gösteriyorsa niceliksel analiz gerçekleştirilemez.Erime eğrisi çift tepe noktaları gösterir ve hedef olmayan tepe noktasının primer dimer mi yoksa spesifik olmayan amplifikasyon mu olduğunu DNA agaroz jel elektroforezi ile yargılamak gerekir.Primer dimer ise primer konsantrasyonunun azaltılması veya yüksek amplifikasyon verimliliğine sahip primerlerin yeniden tasarlanması önerilir.Spesifik olmayan bir amplifikasyon ise lütfen tavlama sıcaklığını artırın veya primerleri spesifik olarak yeniden tasarlayın.
Notlar
Sağlığınızı ve güvenliğinizi sağlamak için lütfen laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi gerekli KKD'yi giyin！
Bu ürün SADECE araştırma amaçlıdır!
