Bitki doğrudan PCR Kiti

Kat No: HCR2020A

Plant Direct PCR Kiti, bitki yapraklarının, tohumlarının vb. doğrudan amplifikasyonu için uygundur ve polisakkaritler ve polifenoller içermeyen bitki örneklerinin yüksek verimli taranması için kullanılabilir.Yönlendirilmiş evrime dayanan doğrudan amplifikasyon DNA polimerazı, bitkilerde PCR inhibitörlerine karşı üstün toleransa sahiptir.Bu arada 5 kb dahilindeki DNA fragmanlarının amplifikasyonuna uygun olan yüksek amplifikasyon performansını da korur.Kitteki benzersiz Lizis Tamponu A, taze veya dondurulmuş bitki dokularını parçalamak için kullanılabilir.Çalıştırılması kolaydır ve lizat, saflaştırmaya gerek kalmadan amplifikasyon için bir şablon olarak kullanılabilir.Sistem, ham numunelerin tekrar tekrar dondurulup çözdürüldükten sonra etkili bir şekilde amplifikasyonunu sağlayan koruyucu maddeler içerir.2 × Plant Direct Master Mix'in amplifikasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için yalnızca primerler ve şablonlar eklemesi gerekir, böylece pipetleme işlemleri azalır ve tespit verimi ve sonuçların tekrarlanabilirliği artar.

Bileşenler

*Tesis Doğrudan Parçalama Tamponu B, numunelerin saklama süresini uzatmak amacıyla Bitki Doğrudan Parçalama Tamponu A'yı nötralize etmek için kullanılan isteğe bağlı bir reaktiftir.Gerçek duruma göre kullanılabilir.

Depolama koşulları

2 × Plant Direct Master Mix, -30 ~ -15°C'de saklayın ve tekrarlanan donma ve çözülmelerden kaçının;Doğrudan Parçalama Tamponunu Bitkilendirin, -30 ~ -15°C veya 2 ~ 8°C'de saklayın.

Deney Süreci

Örnek İşleme–Bitki Yaprağı

Direkt yöntem:Genç yaprakların kullanılması tavsiye edilir.Küçük ve tekdüze bir numune elde etmek için 0,5 – 3 mm sabit çaplı bir delgeç kullanın ve ardından numuneyi doğrudan PCR sistemine ekleyin (50 µl sistem önerilir).Numunenin tüp duvarına karşı değil, PCR çözeltisi içinde olduğundan emin olun.Uzun fragmanları ve karmaşık numuneleri amplifiye etmek için doğrudan PCR kullanılıyorsa, şablon olarak daha küçük çaplı bir numunenin (0,5 – 1 mm) kullanılması daha iyi sonuçların elde edilmesine yardımcı olabilir.

Taşlama lizis yöntemi:Genç yaprakların kullanılması tavsiye edilir.Küçük bir yaprak parçası alın (yaklaşık 1 – 3 mm çapında), 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab'ye yerleştirin ve mümkün olduğu kadar öğütün (bu adım, yaprağı 100 μl pipet ucuyla sıkarak yapılabilir) numuneyi ezmek için).Daha büyük hacimlerde yaprak dokusu kullanılıyorsa (7 mm'yi aşmayın), seyreltme tamponunun hacmini 50 ul'ye artırın.Yapraklar öğütüldükten sonra çözelti yeşil görünmelidir.Kısa bir santrifüjden sonra, reaksiyon şablonu olarak PCR sistemine 1 ul süpernatan ekleyin.

Termal lizis yöntemi:Genç yaprakların kullanılması tavsiye edilir.Küçük bir yaprak parçası alın (yaklaşık 1 – 3 mm çapında), bunu 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A'ya yerleştirin ve 95°C'de 5 – 10 dakika ısıtın.Parçalama süresi, parçalanması zor olan yapraklar için uygun şekilde uzatılabilir (en fazla 20 dakika).Daha büyük hacimlerde yaprak dokusu kullanılıyorsa (7 mm'yi aşmayın), seyreltme tamponunun hacmini 50 ul'ye yükseltin.Isıtmadan sonra kısa bir süre santrifüj edin ve reaksiyon şablonu olarak PCR sistemine 1 ul süpernatan ekleyin.

Örnek İşleme-Bitki tohumu

Taşlama lizis yöntemi:5 mm çapındaki tohumları kesmek için bir neşter kullanın, bunları 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A'ya ekleyin ve numuneyi bir pipet ucu veya başka aletlerle öğütün.Kısaca vorteksleyin ve oda sıcaklığında 3 – 5 dakika bekletin.Tohum numunesinin seyreltme tamponuna batırıldığından emin olun.Kısa bir santrifüjden sonra, reaksiyon şablonu olarak PCR sistemine 1 ul süpernatan ekleyin.

Termal lizis yöntemi:5 mm çapındaki tohumları kesmek için bir neşter kullanın, bunları 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A'ya ekleyin ve 95°C'de 5 – 10 dakika ısıtın.Parçalama süresi, parçalanması zor olan yapraklar için uygun şekilde uzatılabilir (en fazla 30 dakika).Isıtmadan sonra kısa bir süre santrifüj edin ve PCR sistemine reaksiyon şablonub olarak 1 ul süpernatan ekleyin.

A.Uygun büyüklükteki numuneleri kesmek için makas veya başka aletler de kullanılabilir;zımba veya makas tekrar kullanılacaksa numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için her kullanımdan önce %2'lik sodyum hipoklorit solüsyonu ile temizlenmelidir.

B.Bitki Doğrudan Parçalama Tamponunun kullanımdan önce tamamen eridiğinden emin olun.Tamponun viskoz olması veya çökeltilerin olması durumunda, kullanımdan önce tamamen erimesi için 37°C'de ısıtılabilir.

C.Reaksiyon sistemindeki şablonun hacmi, eklenen bitki materyali ve seyreltici hacmindeki farklılığa göre uygun şekilde ayarlanabilir.

Bitki Doğrudan Lizis Tamponu

Bu üründe bulunan Bitki Doğrudan Parçalama Tamponu A, çoğu bitki dokusunun genomunu serbest bırakacak şekilde sıkı bir şekilde optimize edilmiştir ve ham bitkilerin 4°C'de kısa süreli depolanması için uygundur.Numunenin daha uzun bir süre saklanması gerekiyorsa (örneğin 1 – 2 ay), süpernatantın yeni bir EP tüpüne aktarılması ve -20°C'de saklanması önerilir.Numuneleri daha stabil bir şekilde saklamak için, aktarılan süpernatanta eşit hacimde Plant Direct Lysis Buffer B ekleyin, iyice karıştırın ve -20°C'de saklayın.Stabil depolama süresi bitki örneklerine ve durumlarına göre değişir.

Reaksiyon Sistemi

A.Mg içerir²⁺2 mM'lik nihai konsantrasyonda.

B.Her primer için son konsantrasyonun 0,4μM kullanılması tavsiye edilir.Primerlerin aşırı kullanımı spesifik olmayan amplifikasyonun artmasına yol açacaktır.

C.Kullanılan numune miktarı fiili duruma göre ayarlanabilir.Ham lize edilmiş numunenin tek bir reaksiyonunda kullanılan miktar, reaksiyonun toplam hacminin %2 ila %20'si arasında ayarlanabilir.Çok fazla örnek kullanılması amplifikasyonun başarısız olmasına neden olabilir.

Reaksiyon Programı

A.İlk Denatürasyon (98°C, 5 dakika), PCR amplifikasyonu için kullanılabilecek genomik DNA'yı serbest bırakarak bitki dokusunun parçalanmasını teşvik eder.Süreyi kısaltmayın veya sıcaklığı düşürmeyin.

B.Primer Tm değerine eşit veya Tm değerinden 2 ~ 4° daha yükseğe ayarlanması önerilir.Bu üründe kullanılan doğrudan amplifikasyon DNA polimerazı, geleneksel Taq DNA polimerazından farklıdır ve reaksiyon tavlama sıcaklığı için özel gereksinimlere sahiptir; yüksek tavlama sıcaklığının kullanılması, spesifik olmayan amplifikasyonu etkili bir şekilde azaltabilir ve amplifikasyon verimliliğini artırabilir.Karmaşık şablonlar için tavlama sıcaklığının ayarlanması ve uzatma süresinin uzatılmasıyla verimli amplifikasyon elde edilebilir.

C.Amplifikasyon ürününün uzunluğu ≤1 kb ise uzatma süresi 30 saniye/kb'ye ayarlanır;amplifikasyon ürününün uzunluğu >1 kb ise uzatma süresi 60 sn/kb olarak ayarlanır.

D.Karmaşık örnekler veya düşük amplifikasyon verimine sahip örnekler için döngü sayısı uygun şekilde 40-50 döngüye yükseltilebilir.

Uygulamalar

Bitki dokularının doğrudan amplifikasyonu ve polisakkaritler ve polifenoller içermeyen bitki örneklerinin yüksek verimli taranması için geçerlidir.

Notlar

Yalnızca araştırma amaçlıdır.Teşhis prosedürlerinde kullanılmaz.

1. Ham bitki amplifikasyonu veya doğrudan amplifikasyonu için, sistemin, primerlerin ve işlemlerin doğru olduğundan emin olmak amacıyla deneye başlamadan önce saflaştırılmış genomik DNA'nın pozitif kontrol olarak kullanılması tavsiye edilir.

2. Bu kitte kullanılan doğrudan amplifikasyon DNA polimerazı güçlü düzeltme aktivitesine sahiptir.TA klonlamanın yapılması gerekiyorsa adenin eklemeden önce DNA'nın saflaştırılması önerilir.

3. Astar Tasarım Kılavuzu:

A.Astarın 3' ucundaki son bazın G veya C olması tavsiye edilir.

B.Primerin 3' ucundaki son 8 bazda ardışık uyumsuzluklardan kaçınılmalıdır.C.Astarın 3' ucundaki saç tokası yapılarından kaçının.

D.İleri primer ve ters primerin Tm değeri arasındaki farklar 1°C'den fazla olmamalıdır ve Tm değeri 60 ~ 72°C'ye ayarlanmalıdır (Tm değerini hesaplamak için Primer Premier 5 önerilir).

e.Primer Tm değeri hesaplanırken şablonla eşleşmeyen ekstra ek primer dizileri dahil edilmemelidir.

F.Astarın GC içeriğinin %40-%60 olması tavsiye edilir.

G.A, G, C ve T'nin primerdeki genel dağılımı mümkün olduğu kadar eşit olmalıdır.Yüksek GC veya AT içeriğine sahip bölgeleri kullanmaktan kaçının.

H.Primer içinde veya iki primer arasında 5 veya daha fazla bazın tamamlayıcı dizilerinin varlığından kaçının ve iki primerin 3' ucunda 3 veya daha fazla bazın tamamlayıcı dizilerinin varlığından kaçının.

Ben.Spesifik olmayan amplifikasyonu önlemek amacıyla primerin spesifikliğini kontrol etmek için NCBI BLAST fonksiyonunu kullanın.