Urasil DNA Glikozilaz
Urasil-DNA Glikosilaz (UNG veya UDG), 25 kDa moleküler ağırlığa sahip bir E.coli rekombinant klonudur.Urasil içeren tek sarmallı ve çift sarmallı DNA'dan serbest urasil salınımını katalize eder ve RNA'ya karşı aktif değildir ve PCR amplifikasyon ürünlerinin kontaminasyonunu önlemek için kullanılabilir.Etki prensibi, PCR reaksiyonunda dTTP'nin yerine dUTP konulursa ve dU bazları içeren bir PCR amplifikasyon ürünü oluşursa, enzimin tek sarmallı ve çift sarmallı U bazlarının glikosidik bağını seçici olarak kırabilmesi gerçeğine dayanmaktadır. DNA ve PCR amplifikasyon ürününü bozar.
Önerilen Uygulama
Kontaminasyon Önleme Amplifikasyonu
Saklama Durumu
-20°C'de uzun süreli saklama için, kullanımdan önce iyice karıştırılmalıdır, sık donma-çözülmeden kaçınılmalıdır.
Depolama arabelleği
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizatör, %50 Gliserol.
Birim Tanımı
dU bazları içeren 1 µg tek sarmallı DNA'yı 37°C'de 1 saatte parçalamak için gereken enzim miktarı 1 birimdir.
Kalite kontrol
1.SDS-PAGE elektroforetik saflığı %98'den fazla
2.Amplifikasyon hassasiyeti, partiden partiye kontrol, kararlılık
3.1U UNG, 50°C'de 2 dakika süreyle işlendikten sonra, 103 kopyanın altında U içeren şablon tamamen bozunmalı ve hiçbir amplifikasyon ürünü üretilemez
4.Ekzojen nükleaz aktivitesi yok
Talimatlar
| Bileşenler | Hacim (μL) | Nihai konsantrasyon |
| 10 × PCR Tamponu (dNTP içermez, Mg²+özgür) | 5 | 1× |
| dUTP'ler (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 uM |
| dUTP (dTTP'yi değiştirin) | - | 200-600 uM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1.25U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Astar KarışımıA | 2 | 1× |
| Şablon | - | <1μg/reaksiyon |
| ddH₂O | 50'ye kadar | - |
Not: a: qPCR/qRT-PCR için kullanılıyorsa floresan prob reaksiyon sistemine eklenmelidir.Genellikle 0,2 μM'lik son primer konsantrasyonu iyi sonuçlar verebilir;Reaksiyon performansı zayıf olduğunda primer konsantrasyonu 0,2-1 μM aralığında ayarlanabilir.Genellikle prob konsantrasyonu 0,1-0,3 μM aralığında optimize edilir.Primer ve probun en iyi kombinasyonunu bulmak için konsantrasyon gradyanı deneyleri yapılabilir.
Notlar
1.UNG enzimi, PCR amplifikasyon reaksiyonundan önce kontamine dUTP amplifikasyon ürünlerini reaksiyon sisteminden çıkarmak ve daha sonra ürün kontaminasyonu nedeniyle yanlış pozitif sonuçları önlemek için kullanılabilir.
2.Kontaminasyon önleyici PCR reaksiyonunda kullanılacak UNG enzimi için optimum sıcaklık genellikle 2 dakika süreyle 50°C'dir;etkisizleştirme koşulu 5 dakika boyunca 95°C'dir.
3.Sık sık donma-çözülmeden kaçının ve büyük sıcaklık dalgalanmalarına maruz bırakmayın.
4.Amplifiye edilecek farklı genler, dUTP'den farklı yararlanma verimliliğine ve UNG enzimine karşı duyarlılığa sahiptir; bu nedenle, UNG sisteminin kullanımı tespit duyarlılığında bir azalmaya yol açarsa reaksiyon sistemi ayarlanmalı ve optimize edilmelidir, teknik desteğe ihtiyacınız varsa lütfen iletişime geçin Şirketimiz.
