Fare Genotipleme Kiti
Kat No: HCR2021A
Bu ürün, DNA ham ekstraksiyonu ve PCR amplifikasyon sistemi dahil olmak üzere fare genotiplerinin hızlı tanımlanması için tasarlanmış bir kittir.Ürün, Lizis Tamponu ve Proteinaz k ile basit bölünme sonrasında doğrudan fare kuyruğu, kulak, ayak parmağı ve diğer dokulardan PCR amplifikasyonu için kullanılabilir.Gece boyunca sindirim, fenol-kloroform ekstraksiyonu veya kolon saflaştırması yoktur, bu da basittir ve deneylerin zaman alıcılığını kısaltır.Ürün, 2kb'ye kadar hedef fragmanların amplifikasyonu ve 3 çift primere kadar multipleks PCR reaksiyonları için uygundur.2×Fare Dokusu Direkt PCR Karışımı genetik olarak tasarlanmış DNA polimeraz, Mg içerir2+Yüksek amplifikasyon verimliliği ve inhibitör toleransı sağlamak için dNTP'ler ve optimize edilmiş bir tampon sistemi, böylece PCR reaksiyonları şablon ve primerler eklenerek ve ürünü 1x'e yeniden nemlendirerek gerçekleştirilebilir.Bu ürünle amplifiye edilen PCR ürünü, 3' ucunda belirgin bir "A" bazına sahiptir ve saflaştırmadan sonra doğrudan TA klonlaması için kullanılabilir.
Bileşenler
| Bileşen | Boyut |
| 2×Fare Dokusu Doğrudan PCR Karışımı | 5×1.0mL |
| Lizis Tamponu | 2×20mL |
| Proteinaz K | 800μL |
Depolama koşulları
Ürünler -25~-15°C sıcaklıkta 2 yıl saklanmalıdır.Çözüldükten sonra Lysis Buffer, kısa süreli çoklu kullanım için 2~8°C'de saklanabilir ve kullanırken iyice karıştırılabilir.
Başvuru
Bu ürün fare nakavt analizi, transgenik tespit, genotipleme vb. için uygundur.
Özellikler
1.Basit işlem: genomik DNA'nın çıkarılmasına gerek yoktur;
2.Geniş uygulama alanı: Çeşitli fare dokularının doğrudan amplifikasyonu için uygundur.
Talimatlar
1.Genomik DNA'nın salınımı
1) Lizat hazırlanması
Doku lizatı, lize edilecek fare numunesi sayısına göre hazırlanır (doku lizatı dozaja göre yerinde hazırlanmalı ve kullanım için iyice karıştırılmalıdır) ve tek bir numune için gereken reaktiflerin oranı aşağıdaki gibidir:
| Bileşenler | Hacim (μL) |
| Proteinaz K | 4 |
| Lizis Tamponu | 200 |
2) Numune Hazırlama ve Lizis
Önerilen Doku Kullanımı
| Bir çeşitDoku | Önerilen Hacim |
| Fare kuyruğu | 1-3mm |
| Fare kulağı | 2-5 mm |
| Fare parmağı | 1-2 adet |
Temiz santrifüj tüplerine uygun miktarda fare dokusu örneği alın, her santrifüj tüpüne 200μL taze doku lizatı ekleyin, vorteksleyin ve sallayın, ardından 55°C'de 30 dakika inkübe edin ve ardından 98°C'de 3 dakika ısıtın.
3) Santrifüjleme
Lizatı iyice çalkalayın ve 12.000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatan PCR amplifikasyonu için şablon olarak kullanılabilir.Şablonun saklanması gerekiyorsa, süpernatantı başka bir steril santrifüj tüpüne aktarın ve 2 hafta boyunca -20°C'de saklayın.
2.PCR Amplifikasyonu
2×Mouse Tissue Direct PCR Mix'i -20°C'den çıkarın ve buz üzerinde çözün, baş aşağı karıştırın ve PCR reaksiyon sistemini aşağıdaki tabloya göre hazırlayın (buz üzerinde çalıştırın):
| Bileşenler | 25μLSistem | 50μLSistem | Nihai Konsantrasyon |
| 2×Fare Dokusu Doğrudan PCR Karışımı | 12,5μL | 25μL | 1× |
| Astar 1 (10μM) | 1.0μL | 2.0μL | 0,4μM |
| Astar 2 (10μM) | 1.0μL | 2.0μL | 0,4μM |
| Dekolte Ürünüa | Gerektiği gibi | Gerektiği gibi |
|
| ggh2O | 25μL'ye kadar | 50μL'ye kadar |
|
Not:
a) Eklenen miktar sistemin 1/10'unu geçmemelidir, çok fazla eklenirse PCR amplifikasyonu inhibe edilebilir.
Önerilen PCR Koşulları
| Döngü adımı | Sıcaklık | Zaman | Döngüler |
| İlk denatürasyon | 94°C | 5 dakika | 1 |
| Denatürasyon | 94°C | 30 saniye | 35-40 |
| Tavlamaa | Tm+3~5°C | 30 saniye | |
| Eklenti | 72°C | 30 saniye/kb | |
| Son uzatma | 72°C | 5 dakika | 1 |
| - | 4°C | Tutmak | - |
Not:
a) Tavlama sıcaklığı: Primerin Tm değerine referansla, tavlama sıcaklığının primerin daha küçük Tm değerine +3~5°C ayarlanması önerilir.
Yaygın Sorunlar ve Çözümler
1.Hedeflenen şerit yok
1) Aşırı lizis ürünü.Genellikle sistemin 1/10'unu geçmeyecek şekilde en uygun şablon miktarını seçin;
2) Örnek boyutu çok büyük.Lizatı 10 kez seyreltin ve ardından numune boyutunu büyütün veya azaltın ve yeniden lizis yapın;
3) Doku örnekleri taze değil.Taze doku örneklerinin kullanılması tavsiye edilir;
4) Kötü astar kalitesi.Primer kalitesini doğrulamak ve primer tasarımını optimize etmek için amplifikasyon için genomik DNA kullanın.
2.Spesifik olmayan amplifikasyon
1) Tavlama sıcaklığı çok düşük ve çevrim numarası çok yüksek.Tavlama sıcaklığını artırın ve döngü sayısını azaltın;
2) Şablon konsantrasyonu çok yüksek.Şablon miktarını azaltın veya amplifikasyondan sonra şablonu 10 kez seyreltin;
3) Zayıf primer özgüllüğü.Astar tasarımını optimize edin.
Notlar
1.Numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için birden fazla numune alma aleti hazırlanmalı, tekrarlanan kullanım gerekiyorsa her numune alma sonrasında aletlerin yüzeyi %2 sodyum hipoklorit solüsyonu veya nükleik asit temizleyici ile temizlenebilir.
2.Taze fare dokularının kullanılması tavsiye edilir ve amplifikasyon sonuçlarını etkilememek için örnekleme hacmi çok büyük olmamalıdır.
3.Parçalama Tamponu sık donma-çözülmeden kaçınmalıdır ve kısa süreli çoklu kullanım için 2~8°C'de saklanabilir.Düşük sıcaklıkta saklanırsa çökelme meydana gelebilir ve kullanımdan önce tamamen çözülmesi gerekir.
4.PCR Mix, sık sık donma-çözülmeden kaçınmalıdır ve kısa süreli tekrarlanan kullanım için 4°C'de saklanabilir.
5.Bu ürün yalnızca bilimsel deneysel araştırmalar içindir ve klinik teşhis veya tedavide kullanılmamalıdır.
